白灵菇多糖液体发酵工艺的优化*

兰 蓉，张 震，吴 迪，陈亚菲，马 辰

（北京电子科技职业学院，北京 100029）

白灵菇又名阿魏蘑、阿魏菇，是一种野生名贵食（药）用菌。白灵菇营养丰富，据科学测定，白灵菇含蛋白质14.7%、碳水化合物43.2%、脂肪4.3%、粗纤维15.4%、灰分4.8%、多糖19%[1]。由于白灵菇生长在药用植物阿魏上，因此白灵菇具有防癌、抗癌、防治老年人心血管病、妇科肿痛、儿童佝偻病等药用功效[2]。白灵菇中的真菌多糖还有增强人体免疫力、调节人体生理平衡的作用[3]。目前白灵菇的生产多采用传统的固体栽培方式，栽培周期长、生物转化率低，难以满足市场需求。采用液体培养方式发酵生产白灵菇，在短时间内能产生大量的菌丝体和代谢产物，但白灵菇液体发酵方面的研究报道不多[4]。通过对白灵菇液体发酵培养基和培养条件进行筛选及优化，旨在为白灵菇的进一步开发提供科学依据。

1 材料与设备

1.1 材料

白灵菇菌种：由北京薛瑞菌业公司提供；斜面培养基：马铃薯20%、葡萄糖2.0%、琼脂2.0%；液体种子培养基：马铃薯20%、葡萄糖2.0%；发酵基础培养基：马铃薯20%、葡萄糖2.5%、(NH4)2SO40.5%，起始pH为6.5。

试剂：葡萄糖、木糖、果糖、乳糖、蔗糖、NH4NO3、(NH4)2SO4、 NaNO3、 NH4Cl、酵母粉、蛋白胨、HCl、NaOH、蒸馏水、乙醇。

1.2 设备

超净工作台，北京市昌平长城空气净化工程公司，HZQ-Q；生化培养箱，广东省医疗器械厂，LRH-250-A；高压灭菌锅，北京市永光明医疗器械厂，GMSX-280；恒温摇床，武汉瑞华仪器设备有限责任公司，HZ200L；离心机，北京市金仪仪器制造有限公司，TDL-5；恒温干燥箱，北京市东联哈尔仪器制造有限公司，HPG-9145。

2 实验方法

2.1 培养方法

2.1.1 斜面培养

将大小约0.5 cm2的已活化斜面菌种接种到斜面培养基中，27℃培养，直至长满斜面培养基表面。

2.1.2 液体种子制备

250 mL三角烧瓶中装入液体种子培养基100 mL，接种2块～3块约0.5 cm2大小的斜面菌种，置于恒温摇床，140 r·min-1、25℃培养6 d，无菌条件下用无菌长柄剪刀将摇瓶中菌球剪碎，得液体种子。

2.1.3 摇瓶培养

将液体种子按10%（体积比）接种量，接种于装有100 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，并于25℃、140 r·min-1培 养 7 d[20]。

2.2 测定方法

胞外多糖含量的测定：发酵液3500 r·min-1离心15 min，留上清液备用。在上清液中加入95%乙醇至乙醇终浓度为70%，4℃下醇析过夜，离心后将得到的沉淀50℃真空干燥至恒重，称重，即为多糖含量。

2.3 培养基的单因素试验

通过上述摇瓶培养的方式，利用发酵基础培养基，进行单一碳源和氮源筛选实验。

2.3.1 碳源筛选实验

分别用乳糖、蔗糖、果糖和木糖取代发酵基础培养基中的葡萄糖，在其中筛选出最适碳源。

2.3.2 氮源筛选实验

分别用NH4NO3、NaNO3、NH4Cl、酵母粉和蛋白胨取代发酵基础培养基中的 (NH4)2SO4，在其中筛选出最适的氮源。

2.4 培养条件的单因素试验

2.4.1 接种量筛选试验

在发酵基础培养基中分别接种2.5%、5%、10%、15%和20%的液体种子，25℃、140 r·min-1摇床培养 7 d，筛选出最适接种量。

2.4.2 装液量筛选试验

在250 mL的锥形瓶中，分别装入 60 mL、90 mL、120 mL、150 mL、180 mL的发酵基础培养基，均接种10%的液体种子，25℃、140 r·min-1摇床培养7 d，筛选出最适装液量。

2.4.3 培养时间筛选试验

100 mL发酵基础培养基中接种10%的液体种子，25℃、 140 r·min-1摇床培养 7 d，分别培养 5 d、 6 d、 7 d、8 d、9 d，筛选出最适培养时间。

2.4.4 pH筛选试验

分别将发酵基础培养基的起始pH调为4.5、5.0、5.5、6.0、 6.5、 7.0、 8.0，接种 10%，25℃、 140 r·min-1摇床培养7 d，筛选出最适pH。

2.5 正交试验

根据上述单因素实验结果，以白灵菇胞外多糖为指标，安排正交试验，以进一步优化白灵菇液体发酵培养基配方和培养条件，具体的因素和水平见表1和表2。

3 结果与讨论

3.1 培养基的单因素实验结果

3.1.1 碳源筛选实验

表1 液体发酵培养基的正交试验因素水平表

表2 液体发酵培养条件的正交试验因素水平表

碳源对胞外多糖产量的影响结果见表3。

表3 碳源单因素实验结果

从表3可看出，5种碳源中葡萄糖的效果最好，胞外多糖产量达到最高值，果糖次之，木糖最差。

3.1.2 氮源筛选试验

氮源对胞外多糖产量的影响结果见表4。

表4 氮源单因素实验结果

从表4可看出，6种氮源中蛋白胨的效果最好，胞外多糖产量达到最高值，酵母粉次之。

3.2 培养条件的单因素实验结果

3.2.1 接种量筛选试验

5种接种量对胞外多糖产量的影响结果见表5。

表5 接种量单因素实验结果

从表5可看出，随着接种量的增加，多糖产量也随之增加，说明在2.5%～20%范围内，接种量越多越好。

3.2.2 装液量筛选试验

装液量对胞外多糖产量的影响结果具体见表6。

表6 装液量单因素实验结果

从表6可看出，装液量为120 mL时，胞外多糖产量最高。

3.2.3 培养时间筛选试验

培养时间对胞外多糖产量的影响具体见表7。

表7 培养时间单因素实验结果

从表7可看出，胞外多糖含量在第7天时达到最大值，超过第7天多糖含量开始下降。

3.2.4 pH筛选试验

pH值对胞外多糖产量的影响结果见表8。

表8 pH单因素试验结果

从表8可看出，pH值为6.5时效果最好，多糖产量达到最高值，pH7.0次之，4.0最差。

3.3 培养基正交试验结果

白灵菇发酵最适培养基正交试验结果与极差分析结果见表 9。

表9 白灵菇摇瓶发酵最适培养基正交试验结果与极差分析

由表9极差值R可看出，各因素对白灵菇发酵产胞外多糖的影响先后顺序是A＞C＞B，即碳源对胞外多糖产量的影响最大，无机盐其次，氮源的影响相对最弱。从优水平来看，白灵菇发酵产胞外多糖的最佳培养基组合为A3B3C1，而胞外多糖产量最多的培养基组合为A2B3C1，经3次重复实验验证，得白灵菇发酵产胞外多糖的最佳培养基组合为A2B3C1，即葡萄糖2%、蛋白胨0.75%、CaCl20.2%。

3.4 培养条件正交试验结果

白灵菇发酵最适培养条件正交试验结果与极差分析结果见表10。

表10 白灵菇发酵最适培养条件正交试验结果与极差分析

由表10极差值R可看出，各因素对白灵菇发酵产胞外多糖的影响先后顺序是A=D>B>C，即起始pH值和培养天数对胞外多糖产量影响最大，接种量其次，装液量的影响相对最弱。从优水平来看，白灵菇发酵产胞外多糖的最佳培养条件组合为A3B2C2D2，而胞外多糖产量最多的培养条件组合为A3B3C2D1，经3次重复实验验证，得白灵菇发酵产胞外多糖的最佳培养条件组合为A3B3C2D1，即起始pH值7.0，接种量20%，装液量120 mL，培养天数6 d。

4 结论

根据上述实验结果，得出白灵菇液体发酵产胞外多糖最佳培养基组合：葡萄糖2%、蛋白胨0.75%、CaCl20.2%；白灵菇液体发酵产胞外多糖最佳培养条件为：起始pH值7.0，接种量20%，装液量120 mL，培养天数6 d。

[1]申进文，闫永先.白阿魏蘑菌种培养基筛选试验[J].食用菌，2000(20)：28.

[2]林杰.白灵菇栽培技术要点[J].中国食用菌，2000，19(5)：28-29.

[3]陈忠纯.阿魏侧耳的栽培技术[J].干旱区研究，1994，11(2)：65-68.

[4]赵永勋.食药用菌液体发酵的现状和展望[J].农业与技术， 2004，24(3)：111-114.