灵丹菌质双向发酵工艺及药效品质研究*

许晓燕，郑林用，李 艳，江 南，余梦瑶，罗 霞**

（1.四川省中医药科学院中药细胞与分子生物学实验室，四川 成都 610041；2.四川省农业科学院，四川 成都 610066；3.成都市经济信息中心，四川 成都 610041）

灵芝（Ganoderma lucidum）是一种广泛应用的药、食兼用真菌，具有促进睡眠、缓解机体疲劳、抗肿瘤、调节免疫、抗HIV等功效[1]。近年来，庄毅等提出用现代生物技术来改造灵芝等药用真菌，即 “药用真菌新型固体发酵工程”，在发酵基质中增用具有活性成分的各种中药材作为药性基质，使发酵的作用不仅是提供营养成分，而且因真菌的分解和合成作用产生新的成分，使其性质发生变化，从而使药用真菌和中药材原有功效增强，甚至可以产生新的性味、功能，这就具有双向性，其发酵产物称为菌质[2]。

丹参，为唇形科鼠尾草属丹参 （Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根茎，始载于 《神农本草经》，列为上品，具有活血调经、祛瘀生新、镇静安神、凉血消痛、消肿止痛等功效。在丹参采摘、加工过程中，除去入药的部分，会产生大量的废弃。现代研究表明，边角料中具有与药材相似的化学成分，只是含量较低，将其直接废弃，不仅对环境造成污染，而且浪费了大量具有潜在价值的资源。

本论文采用新型（双向性）固体发酵工程技术，以灵芝为发酵菌株，在其培养基中增添丹参边角料，通过培养基优化，初步建立灵丹菌质的生产工艺，并检测灵丹菌质的理化指标（蛋白质、多糖、三萜等），开展其活血化瘀的药效学研究，旨在为现代菌物药的研发提供一种新材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

美国大灵芝（Ganoderma sp.），中国农大生物学院食用菌研究室提供。

1.1.2 试验药材

丹参边角料，购自四川省中江县；丹参药材，购自四川省成都市中药材市场。

1.1.3 试验动物

昆明种小鼠，由四川省中医药科学院实验动物中心提供（川实质第2002－33号）。

1.1.4 主要试剂

蒽酮（上海化学试剂采购供应五联化工厂）；考马斯亮蓝G-250（上海朗瑞精细化学品有限公司）；丹参酮ⅡA、齐墩果酸（中国药品生物制定鉴定所）。

1.1.5 主要仪器

智能光照培养箱，型号：ZGX-300C，杭州钱龙仪器设备有限公司；紫外分光光度计，型号：T6新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司；HPLC系统，型号：Waters 1525，Waters公司；Syncore多样品定量浓缩仪，瑞士Buchi。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵样品制备

灵丹菌质不同发酵组合培养基配方见表1。

表1 灵丹菌质不同发酵组合培养基配方比例

按表1配置各组合固体发酵培养基，控制含水量在60%左右，分装入袋，115℃灭菌3 h，冷却后，接入灵芝斜面菌丝（以长度1.0 cm菌丝体为标准），于恒温 (27±2)℃进行发酵培养。

1.2.2 菌丝体日平均生长速度观察

从菌丝体萌发起，记录发酵过程中灵芝菌丝体在各组合培养基质上的平均生长速度。

1.2.3 灵丹菌质多糖、蛋白质和三萜测定

多糖含量测定采用2005版药典规定方法[3]硫酸－蒽酮法，蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法，三萜含量测定采用草醛冰醋酸－高氯酸显色法[4]。

1.2.4 灵丹菌质丹参酮IIA含量的HPLC分析

HPLC条件为检测流动相：甲醇∶水=75∶25；检测温度：30℃； 进样量为20 μL； 流速：1 mL·min-1； 检测波长 270 nm。检测方法为取菌质粉末0.1 g，加入10 mL甲醇，封闭试管口，超声提取10 min，静置过夜，HPLC测定。

1.2.5 试药制备

（1）水提：取定量样品，加10倍蒸馏水，90℃水浴2.5 h，3000 r·min-1离心30 min，取上清；沉淀再加5倍水、3倍水，同法热提2次；收集3次热提所得上清液。

（2）醇提：向水提后的样品中加入2倍体积的95%乙醇，超声提取 3 h，3000 r·min-1离心30 min，收集上清液，旋转蒸发至结晶。

（3）将步骤（2）所得结晶溶于步骤（1）中所得提取液，挥发至所需浓度即为药效学实验给药样品。

1.2.6 对急性脑缺血缺氧小鼠的保护作用

参照 《中药药效研究思路与方法》[5]。

1.2.7 对小鼠凝血时间（CT）的影响

参照 《中药药效研究思路与方法》[5]。

1.2.8 对小鼠尾出血时间的影响

参照 《中药药效研究思路与方法》[5]。

1.2.9 对小鼠尾部血栓形成的影响

参照 《中药药效研究思路与方法》[5]。

2 结果与分析

2.1 不同培养基组合菌丝体生长速度的观察

从灵芝菌丝体萌发开始，以2 d～3 d为1个时间单位，记录菌丝体在固体发酵培养基上的生长速度，得到灵芝菌丝体生长速度曲线，如图1所示。

图1 灵芝在不同组合中的菌丝体生长速度

从图1可以看出，菌丝生长可分为5个阶段：适应生长期，菌丝生长较慢，菌丝较纤弱；旺盛期，菌丝活力较强，代谢旺盛，生长快；下降期，菌丝生长速度急剧下降；回升期，菌丝生长速度有所回升；衰退期，菌丝活力衰退，菌丝老龄化，开始分泌黄褐色素。结果表明，菌丝生长至接种大约15 d后，生长速度趋于平稳且缓慢下降，至30 d后，生长速度趋于平缓不变。

2.2 不同灵丹菌质组合的多糖含量

测定发酵40 d后，菌质的多糖含量，如图2所示。

从图2可以看出，发酵40 d后，菌质组合4的多糖含量最高。

2.3 不同灵丹菌质组合的蛋白含量

发酵40 d后，测定菌质的蛋白质含量，测定结果如

图2 各组合灵丹菌质多糖含量变化

图3所示。

图3 各组合灵丹菌质蛋白含量变化

从图3可以看出，发酵40 d后，菌质组合4的蛋白质含量最高。

2.4 不同灵丹菌质组合的灵芝酸三萜含量

发酵40 d后，测定菌质的三萜含量，测定结果如图4所示。

图4 各组合灵丹菌质三萜含量

随着丹参边角料添加比例的逐渐增大，三萜的含量也基本呈现逐渐增大的趋势，提示灵丹菌质中三萜的含量可能与添加的药材比例相关。

2.5 不同灵丹菌质丹参酮IIA含量

发酵40 d后，测定菌质的丹参酮IIA含量，测定结果如表图5所示。

图5 各组合灵丹菌质丹参酮IIA含量

从图5可以看出，组合3和组合4的丹参酮IIA含量最高且相同。

2.6 对急性脑缺血缺氧小鼠的保护作用

从图2～图5可以看出，灵丹菌质组合4在40 d中止发酵后，发酵产物多糖、蛋白质、三萜和丹参酮IIA含量较高，因此选取组合4的发酵产物进行活血化瘀的药效学研究。

2.6.1 对急性不完全脑缺血小鼠的作用

观察灵丹菌质组合4对小鼠急性脑缺血的保护作用，实验结果如表2所示。

表2 对急性脑缺血缺氧小鼠的保护作用（x±s，n=10）

相比空白对照组，丹参药材组、组合4对急性不完全脑缺血小鼠的存活时间均无明显的延长作用，但是组合4具有一定的作用趋势。

2.6.2 对断头后小鼠喘息时间（急性脑缺氧）的影响

观察灵丹菌质组合小鼠断头后急性脑缺氧的保护作用，实验结果如表2所示，相比空白对照组，丹参组、组合4对断头后急性脑缺氧小鼠的喘气时间均无延长作用，但对小鼠断头造成的急性脑缺氧实验模型而言，短暂延长断头小鼠喘气时间数秒，仍可视为对小鼠急性脑缺氧有一定的改善作用，因此，组合4对小鼠急性脑缺氧有一定的改善作用。

2.7 对小鼠凝血时间（CT）的影响

观察灵丹菌质对小鼠凝血时间的影响。实验结果如表3所示。

表3 灵丹菌质对小鼠凝血、尾出血时间的影响（x±s，n=10）

相比空白对照组，组合4给药组的小鼠凝血时间明显长于空白对照组（p<0.05）。

2.8 对小鼠尾出血时间的影响

观察灵丹菌质组合4对小鼠尾出血时间的影响。实验结果如表3所示，相比空白对照组，组合4给药组的小鼠尾出血时间明显长于空白对照组（p<0.05）。

2.9 对小鼠尾部血栓形成的影响

观察灵丹菌质对小鼠尾部血栓形成的影响，实验结果如表4所示。

注射角叉菜胶24 h后，组合4就表现出明显的抑制血栓形成作用（p<0.01）；48 h后，丹参药材组也表现出明显的抑制血栓形成的作用（p<0.01）；72 h后，2个给药组均表现出一定的抑制血栓形成的作用。

表4 灵丹菌质组合4对小鼠尾部血栓形成的影响（x±s，n=10）

3 讨论

在传统的固体发酵中，基质的作用仅是单向性地为真菌生长提供所需碳、氮等营养，以获得子实体为目的，很少注意发酵过程中基质本身的变化，以及不同基质对发酵产物品质的影响。近年来，国内外的研究者已开始研究在培养基中加入药用植物，进行固体发酵来提高发酵产物的品质，如槐芪菌质[6]、韩国药性米酒[7]。本试验选用中药材为灵芝的培养基质之一，不仅观察了在培养基质中添加不同比例的丹参药材后，灵芝生长情况及菌质多糖、蛋白质、三萜、丹参酮的变化趋势，还进行了菌质提取物活血化瘀的药效学试验。试验结果表明，从菌丝体日平均生长曲线图可以看出，在组合2、组合3、组合4三个培养基中，灵芝的生长速度较快，其中在组合4中，其生长最快（0.62 cm·d-1）。从多糖、蛋白质、三萜、丹参酮的含量来看，40 d后，组合4的多糖、蛋白质、灵芝酸三萜、丹参酮含量较高。综合前面生长情况和成分分析的结果，选取组合4进行小鼠活血化瘀的药效学实验。药效试验表明，灵丹菌质在脑缺血、缺氧和活血化瘀方面具有比丹参药材更好的功效；组合4同时具有延长小鼠凝血时间、尾出血时间和抗血栓的作用，表现出良好的活血化瘀功效。

本研究表明，利用有益菌进行双向发酵能够有效提高中药基质中的药用成分，能够为菌物药研发提供一种新材料和新思路，并证实了新型固体发酵这种思路的合理性。

[1]Russell R，Paterson M.Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory[J].Phytochemistry，2006，67(2)： 1985-2001.

[2]庄毅，潘扬，谢小梅.药用真菌 “双向发酵”的起源、发展及其优势与潜力[J].中国食用菌，2007，26(2)：3-6.

[3]国家药典编委会.中华人民共和国药典[S].化学工业出版社，2005.

[4]郑林用，黄小琴，曾瑾.不同灵芝菌株多糖、三萜化合物比较分析[J].四川大学学报：自然科学版，2007(5)：1121-1124.

[5]陈奇.中药药效研究思路与方法[M].北京：人民卫生出版社，2005.

[6]庄毅，池玉梅，陈慎宝.药用真菌新型固体发酵工程与槐芪菌质的研制[J].中国药学杂志，2004，29(3)：175-178.

[7]Kim JH,Lee DH,Lee SH.Effect of Ganoderma lucidum on the quality and functionality of Korean traditional rice wine,Yakju[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2004,97(1):24-28.