猪细小病毒BQ株灭活疫苗免疫剂量及免疫持续期的初步研究

张振梅，张超范，崔尚金*，刘芹防，祝 超,2，姚贵哲,2

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001；2.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春130118)

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)属于细小病毒科细小病毒属，是引起母猪繁殖障碍性疾病的最重要病原之一，能导致仔猪死产、木乃伊胎、早期胚胎死亡和不育[1]。PPV除了能直接导致母猪的繁殖障碍外，往往与其它病原体混合感染，例如PPV能与猪圆环病毒二型混合感染引起断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)[2]，还有报道PPV可能与仔猪皮炎有关。自PPV发现以来，该病已呈世界分布。目前在我国，PPV感染十分严重，抗体阳性率达90%以上。PPV主要通过病猪和带毒猪消化道和呼吸道传播，还可垂直传播，给养猪业造成严重的经济损失[3]。

灭活疫苗是将病原体经灭活后仍保持其免疫源性。灭活疫苗具有安全性好，诱导抗体时间长，不需要低温保存等优点。目前，灭活苗免疫是预防PPV感染的最有效的手段[4]。本实验进行了现地分离株BQ株[5]灭活疫苗的不同免疫剂量的免疫效果及免疫持续期实验，并与市场上销售的两种PPV灭活疫苗进行同类产品的免疫效果比较试验。

1 材料和方法

1.1 灭活疫苗 PPV为BQ株为现地分离株，由本实验室分离保存；其灭活疫苗按照文献[6]的方法，以ISA15 AVG为佐剂制备，病毒TCID50≥106/mL，血凝价≥210/0.25 mL。

1.2 免疫试验 筛选PPV抗体阴性猪18头，分成6组，每组3头。1组～3组分别免疫BQ株灭活疫苗1 mL、2 mL、4 mL，4组～5组按照说明书免疫市场上销售的A、B两种PPV灭活疫苗，6组为阴性对照组(仅接种油佐剂)。2周后进行二免，二免的剂量与免疫方式与首免相同。定期检测血清抗体水平。

1.3 血清抗体检测 分别在首次免疫前和免疫后1周～6周每周静脉采血分离血清，检测抗体产生情况；8周～24周每隔4周静脉采血分离血清，检测抗体持续期。分别用ELISA和HI方法检测血清中PPV抗体。ELISA方法参照Svanova公司PPV抗体检测试剂盒说明操作，HI方法按照文献[7～9]操作。

1.4 统计学分析 所取得的数据应用SAS软件对数据进行分析，并绘制抗体变化曲线。

2 结 果

2.1 抗体检测结果 免疫前1周，免疫当天，以及免疫以后定期采血，常规分离血清，进行ELISA和HI测定，所得实验数据汇总列表(表 1)。根据Svanova公司试剂盒说明，ELISA结果cut-off平均值小于50判定为阴性，50～80之间判定为阳性，大于80判定为强阳性。HI结果小于8(log2 HI＜3）判定为阴性，8～512之间(3＜log2 HI＜9)判定为阳性，大于512(log2 HI＞9)判定为强阳性[10]。第6组通过2种方法检测血清抗体始终为阴性，表明试验猪在免疫试验过程中没有感染PPV而产生抗体。

2.2 数据分析 第6组通过2种方法检测血清抗体始终为阴性，表明试验对照猪在免疫试验过程中没有感染PPV，没有产生抗体，对照成立；也证实1组～5组产生的抗体是由疫苗免疫所产生的。

2.2.1 PPV-BQ株疫苗不同剂量免疫结果分析 第1组免疫后第2周出现1头猪抗体转阳，到第5周全部阳转；第2组免疫后第2周出现1头猪抗体转阳，第4周全部阳转；第3组在免疫1周左右出现1头猪抗体转阳，第3周全部阳转。加强免疫后，抗体滴度随时间延长而逐步快速升高，第2组和第3组在第5周时呈现强阳性，而第1组时间稍微缓慢一点，到第6周时达到强阳性。3组不同剂量的PPV-BQ疫苗免疫后第8周抗体都达到最大值，抗体滴度相近，随后都在高值维持。应用HI和ELISA分级别进行测定，HI与ELISA检测结果呈现高度相关。不同剂量的3组PPV-BQ免疫抗体ELISA及HI抗体结果见图1。

对ELISA及HI结果进行统计学分析，1组～3组注射不同剂量PPV-BQ株灭活苗抗体产生效果组间差异不显著(p＞0.05)，对2种抗体检测数据统计结果相同，表明PPV-BQ株疫苗注射1 mL即可以达到较好的免疫效果，只是转阳期与免疫2 mL和4 mL相比滞后一些。

2.2.2 PPV-BQ株疫苗不同剂量免疫持续期结果分析 免疫不同剂量PPV-BQ株疫苗，在免疫后第8周抗体水平达到最高，直到免疫后24周仍保持最高的抗体水平。表明免疫持续期至少可以达到24周。

2.2.3 PPV-BQ株疫苗与市售2种疫苗对比结果分析 第4组免疫后2周出现1头猪抗体转阳，4周全部阳转；第5组免疫后3周出现1头猪抗体转阳，6周全部阳转。市售疫苗A免疫后5周达到抗体强阳性，疫苗B免疫后8周达到抗体强阳性。注射1 mL PPV-BQ株疫苗与市售2种疫苗(各2 mL)，免疫后抗体ELISA及HI抗体检测结果平均值比较结果见图2。

表1 抗体检测结果Table 1 The detection of PPV antibody

经ELISA及HI结果进行统计学分析，PPV-BQ疫苗组与市售A疫苗组差异不显著(p>0.05)，市售B疫苗与另2组差异极显著(p<0.01)，对2种抗体检测数据统计结果结果相同。结果说明注射PPV-BQ 1 mL与市售A疫苗免疫效果相似，明显优于市售B疫苗。

3 讨 论

PPV病作为一种重要的母猪繁殖障碍疾病，疫苗免疫预防是控制该病的主要手段。由于PPV对母猪和种猪的危害都很大，现在国内规模化猪场的存栏母猪及种猪场的种猪和后备种猪都需要进行该病的免疫预防接种，因此，PPV疫苗的市场需求量很大。灭活疫苗作为预防PPV常用疫苗，具有安全、长效等很多优点，但存在普通油佐剂疫苗效果不稳定等因素，所以研制安全有效的疫苗仍是目前研究的重点[13]。本实验研究了PPV-BQ灭活疫苗不同免疫剂量的免疫效果以及抗体的持续期，该疫苗使用的是新型佐剂ISA15 AVG，实验结果表明，1 mL～4 mL的免疫剂量都产生了较高的抗体，并且免疫后6个月内都能持续较高的抗体水平。在这个剂量范围内均可产生良好的免疫效果，而且免疫持续期相近。本实验同时与市场上购买的2种PPV灭活疫苗的免疫效果进行了比较，结果显示，PPV-BQ灭活苗的免疫效果与PPV-A疫苗效果相似(p＞0.05)，均明显优于 PPV-B疫苗(p＜0.01)。说明灭活苗PPV-BQ达到了目前市场上销售的PPV灭活疫苗的免疫效果。

在PPV监测及疫苗免疫效果评价的过程中，目前大多应用HI进行检测[12-15]。本实验对免疫猪血清PPV抗体同时应用了HI方法和Svanova公司ELISA抗体检测试剂盒进行检测，检测结果表明2种检测方法具有明显的相关性。因此检测PPV抗体时，可以用ELISA试剂盒，这不仅简化了实验过程，而且排除了不同批次实验的人为因素的影响，提高了不同批次间试验结果的同一性。

本实验只是对不同免疫剂量疫苗免疫后血清抗体水平及免疫持续期进行了研究，细胞免疫和其他工作正在进一步研究中。

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