鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其B细胞表位的鉴定

宋 扬，韩宗玺，邵昱昊，孔宪刚，刘胜旺

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001)

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由IB病毒(IBV)引起的一种鸡急性高度接触性传染病。IBV是冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)第3群禽冠状病毒的代表株[1]。其基因组编码4种结构蛋白：纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和小膜蛋白(E)。N蛋白为磷酸化蛋白，由409个氨基酸组成，占病毒蛋白总量的40%，分子量约51 ku[2]。N蛋白具有较高的保守性，据报道，N蛋白中间部分比两端更为保守，各病毒株之间在氨基酸的238位～293位之间高度一致[3]。N蛋白在病毒的复制和转录中起作用，主要作用是与病毒RNA结合形成核衣壳[4]。此外，N蛋白具有良好的免疫原性，可在体内产生高水平的抗体并介导细胞毒性T反应[5]。本研究旨在获得针对IBV N蛋白的特异性单克隆抗体(MAb)，精确定位IBV N蛋白的抗原表位，在分子水平上揭示N蛋白的抗原结构。

1 材料和方法

1.1 病毒株和质粒 IBV致弱株CK/CH/LDL97Ⅰ由本实验室分离、致弱和保存。原核表达重组质粒pGEX-6p-1-N为本实验室构建并保存。

1.2 实验动物及细胞 BALB/c小鼠购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心；骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存。

1.3 主要试剂 培养基DMEM购自Invitrogen公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FICA)、聚乙二醇(PEG，MW 1450)、HAT、HT、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG、MAb亚类鉴定试剂盒均购自Sigma公司；胎牛血清购自Hyclone公司；噬菌体展示随机12肽库(Ph.D-12TMPhage Display Peptide Library Kit)购自NEB公司。

1.4 重组N蛋白的制备 重组蛋白的制备按文献[6]的方法进行。

1.5 动物免疫与细胞融合 取重组蛋白(0.15 mg/mL)与等体积弗氏完全佐剂乳化，皮下接种6周龄～8周龄BALB/c小鼠(0.3 mL/只)，每隔2周后等量抗原与弗氏不完全佐剂乳化，进行第2次(病毒抗原)和第3次免疫；最后1次以纯重组蛋白加强免疫，第4 d检测抗体水平，第7 d取脾脏进行细胞融合。融合过程参照文献[6]方法进行。

1.6 杂交瘤细胞株筛选与克隆化 以纯化的IBV作为包被抗原，通过间接ELISA方法检测杂交瘤细胞生长孔上清液中的抗体，以抗体效价大于阴性对照OD490nm值2倍以上者判为阳性。将阳性孔细胞以有限稀释法连续3次细胞克隆纯化。

1.7 腹水制备及效价测定 选取8周龄～10周龄的雌性BALB/c小鼠，腹腔注射无菌石蜡油(0.5 mL/只)，7 d～10 d后，腹腔注射杂交瘤细胞5×106个/只，待小鼠腹部膨大后抽取其腹水，并采用间接ELISA法测定其抗体效价。

1.8 MAb生物学活性的鉴定

1.8.1 MAb亚类的鉴定 按照Sigma公司亚类鉴定试剂盒进行鉴定。

1.8.2 MAb western blot分析 将纯化的重组N蛋白、GST蛋白、IBV、性尿囊液进行SDS-PAGE电泳，转印到硝酸纤维素膜，转印结束后，用含5%脱脂乳4℃封闭过夜，PBST(Tween-20，0.05%)洗涤3次，加入腹水MAb，室温感作2 h，PBST洗涤3次，然后加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶10 000)，室温感作2 h，用3，3'-二氨基联苯胺(DAB)底物溶液进行显色，蒸馏水终止反应。

1.8.3 MAb间接ELISA 以纯化的IBV和重组N蛋白分别包被ELISA检测板，以筛选的阳性杂交瘤细胞上清为一抗，重组N蛋白阳性血清、阴性血清作为标准阴阳性对照，HRP标记的山羊抗鼠lgG为二抗，OPD显色，在酶标仪上读取OD490nm值。同时，用IDEXX公司标准IBV抗体检测ELISA试剂盒鉴定MAb的特异性。

1.9 N蛋白MAb抗原表位的筛选 参照NEB噬菌体展示随机12肽库操作手册，进行3筛选。

1.10 表位多肽的精确定位 根据筛选结果，人工合成相应表位基因的两条互补寡核苷酸链，上游引入BamHⅠ粘性延伸末端，下游引入终密码子以及SalⅠ粘性延伸末端。序列为：S：5'-GGATCCTT TGGCCCTCGTACTAAATAGG-3'； R： 5'-GTCGAC CTATTTAGTACGAGGGCCAAAG-3'。将2条互补链退火形成带粘性末端的双链DNA，插入pGEX-6p-1中，转化BL21(DE3)感受态细胞，酶切鉴定重组质粒，命名为pGEX-Ep。对重组菌进行IPTG诱导表达,并将表达的重组蛋白(GST-Ep)进行SDS-PAGE电泳和western blot分析。

1.11 抗原表位的保守性分析 分别取IBV 7个血清型的一个代表毒株进行western blot分析并运用DNAStar分析该表位短肽的氨基酸序列与IBV其它毒株相应区域的同源性。所用毒株及其GenBank序列号如下：CK/CH/LDL/97Ⅰ(EF602445)、CK/CH/LHLJ/04V(DQ352153)、CK/CH/LSD/05Ⅰ(EU637854)、H120 (EU714028)、 tl/CH/LDT3/03 (AY702975)、CK/CH/LSC/99Ⅰ(DQ287916)、Australia-T(U52596)。

2 结 果

2.1 MAb制备

2.1.1 MAb杂交瘤细胞株的建立 细胞融合后，经间接ELISA筛选，获得了1株能稳定分泌抗鸡IBV N蛋白的MAb细胞株，命名为6D10。经检测，MAb 6D10腹水的间接ELISA效价为105。

2.1.2 MAb生物学活性的鉴定

2.1.2.1 MAb亚型鉴定：按照Sigma公司亚类鉴定试剂盒对MAb的亚型鉴定，结果：MAb 6D10的重链为IgG1、轻链为κ链。

2.1.2.2 MAb western blot分析：为了检测所获得的MAb是否特异地针对IBV的N蛋白，我们采用western blot方法检测杂交瘤细胞分泌上清与全病毒的反应性，结果表明，MAb 6D10能与IBV CK/CH/LDL97Ⅰ毒株发生反应，在约55 ku处出现一条特异性条带，与重组N蛋白反应在约72 ku处出现特异性条带而与阴性尿囊液和GST蛋白则没有反应(图1)。表明所获得的MAb能够特异性的识别IBV与重组N蛋白。

2.1.2.3 间接ELISA检测特异性：间接ELISA结果显示，MAb 6D10能与CK/CH/LDL97Ⅰ尿囊液毒和重组N蛋白发生特异性反应(图2)，表明本实验得到的MAb 6D10是特异性针对IBV的N蛋白。为了更进一步确定MAb的特异性，我们用IDEXX标准IBV抗体检测ELISA试剂盒来鉴定该株MAb的特异性，结果显示MAb 6D10同试剂盒中的IBV标准抗原发生阳性反应(图3)，结果又进一步证明本实验获得的MAb是特异性针对IBV的N蛋白。

2.2 表位鉴定结果

2.2.1 淘选产率 以每一轮淘选时加入噬菌体的量记作投入量，洗脱后噬菌体的量记作产出量，按照产率=产出量/投入量×100%计算出3轮淘选噬菌体的产率。经过3轮淘选，噬菌体的产率明显升高(表1)，表明在淘选过程中与MAb 6D10特异性结合的噬菌体的比例有明显的升高，即发生了特异性噬菌体的富集。

表1 噬菌体展示肤库淘选结果Table 1 The results of 3 rounds of biopanning of display peptide library

2.2.2 噬菌体ELISA检测结果 扩增随机提取的14个噬菌体克隆，然后进行与MAb 6D10的ELISA反应，结果11个噬菌体克隆与MAb 6D10发生阳性反应，而与BSA对照孔不发生反应(图4)。

2.2.3 DNA序列测定及表位分析 将11个噬菌体阳性克隆进行DNA测序并对展示的短肽进行序列比对，结果10个噬菌体克隆展示一组共有序列FGPRTK，而剩下的1个噬菌体克隆没有发现共有序列。将噬菌体肽库展示的共有氨基酸序列与IBV N蛋白序列比较发现，该氨基酸序列与位于N蛋白242位～247位的氨基酸序列完全一致(图5)，因此，我们推测FGPRTK可能是一个线性B细胞表位。

2.2.4 B细胞表位的定位将重组质粒 pGEX-6p-1-Ep转化到大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导，使其表达GST融合蛋白GST-Ep，Western blot分析表明MAb 6D10可以与GST-Ep融合蛋白发生特异性反应，但却不与GST蛋白发生反应；FGPRTK为MAb 6D10识别序列，即242FGPRTK247为IBV CK/CH/LDL97ⅠN蛋白上的一个线性B细胞表位(图6)。

2.2.5 表位的保守性及同源性分析结果 为了检测MAb 6D10与不同IBV毒株的反应性，选取7个代表IBV不同血清型的毒株进行western blot分析。结果显示，MAb 6D10与所有所选的IBV毒株在54 ku处都有明显的条带(图7)。序列分析结果显示，表位序列(IBV CK/CH/LDL97ⅠN蛋白242 aa～247 aa)与所有所选的IBV分离株N蛋白相应区域(242 aa～247 aa)的序列完全相同(图8)。因此，本研究鉴定的N蛋白线性B细胞表位242FGPRTK247在所比较的经典疫苗毒株、变异毒株等IBV毒株中完全同源，是一个高度保守的线性B细胞抗原表位。

3 讨 论

IBV N蛋白一般由409个氨基酸组成，分析表明其分子量应在51 ku～54 ku之间[7]。早期认为IBV的N基因较为保守[4]，而Sapats等认为N基因上存在着新的变异。通常认为IBV主要结构蛋白中S1糖蛋白在诱导鸡的免疫保护中起主要作用[8-9]，但Boot等认为N蛋白也是免疫识别的重要靶位。研究编码N蛋白重组DNA的免疫原性发现：用表达的融合N蛋白首免小鼠和鸡，均能引起对IBV完整病毒粒子的免疫应答。用N蛋白免疫鸡后，能使鸡淋巴细胞增生和对IBV产生特异性迟发型超敏反应，这表明N蛋白不仅能激活T细胞，对完整的IBV粒子产生免疫应答，同时也能激活T辅助细胞，增强B淋巴细胞产生抗体的能力[10-12]。Ignjatovie等也发现N蛋白具有较多的抗原决定簇，而且N蛋白携带的所有抗原决定簇均能产生交叉反应性抗体[4]。因此，N蛋白有望作为群特异性诊断抗原或新型疫苗的有效成分。本实验将IBV毒株CK/CH/LDL97Ⅰ病毒与重组N蛋白混合作为免疫原，免疫小鼠，通过细胞融合，建立了1株能稳定分泌抗鸡IBV N蛋白MAb的杂交瘤细胞株6D10。Western blot分析显示，MAb 6D10与CK/CH/LDL97Ⅰ病毒株反应可见一条明显的条带，与报道的N蛋白大小相符；与重组N蛋白反应可见两条明显条带，这可能是N蛋白在原核表达中产物降解，或与蛋白的翻译后修饰或磷酸化有关[13]，因为磷酸化形式蛋白在电泳时要比非磷酸化形式慢的多，因此形成两条带。ELISA检测中MAb 6D10与重组N蛋白及全病毒反应性良好，数值较高，表明本实验得到的MAb 6D10是特异性针对IBV的N蛋白，而IDEXX ELISA抗体检测试剂盒的实验结果进一步验证了我们的结论。随后我们以筛选到的MAb 6D10为靶分子，利用噬菌体展示技术对IBV N蛋白上的抗原表位进行了筛选，3轮淘洗后获得了一个共有序列FGPRTK，对应于IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株N蛋白242位～247位氨基酸序列。人工合成这个多肽的编码序列并进行原核表达，利用MAb 6D10对表达产物进行western blot分析，结果显示FGPRTK为IBV N蛋白的一个线性B细胞表位。同源性分析结果显示，该表位在所比较的包括经典疫苗H120在内的7个血清型IBV毒株中同源性为100%，因此表位FGPRTK为IBV N蛋白的一个保守的线性B细胞表位。

本研究制备了一株抗鸡IBV N蛋白的MAb，并鉴定了N蛋白上高度保守的线性B细胞抗原表位：242FGPRTK247。该结果为进一步了解IBV的抗原结构和IBV诊断试剂及多表位疫苗的研究奠定了基础。

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