山西亚群H5N1亚型HPAIV对鸭及鸭胚的继代感染研究

张 翼，段振华，刘丽玲，施建忠，田国彬，曾显营，陈化兰，李雁冰

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室/国家禽流感参考实验室，黑龙江哈尔滨150001)

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的一种禽类(家禽和野禽)的感染和/或疾病综合征，根据其临床症状分为高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)和低致病性禽流感(Low pathogenic avian influenza，LPAI)。

水禽尤其是鸭被认为是AIV的自然宿主，AIV的所有亚型均可在世界范围内的野鸭体内分离到[1-2]。早期研究表明，野生水禽中AIV似乎处于进化的静止状态[3-4]。1999年～2002年从健康鸭体内分离的H5N1亚型AIV对鸡和小鼠均表现出致病性，而对鸭不致病[5]，鸭在感染HPAI病毒(HPAIV)时呈隐性感染，表现为温和症状或不表现症状[6]。然而近年来，H5N1亚型HPAIV对鸭的致病力显示出不断增强的趋势，从原来以减蛋而不引起死亡为特征的流行特点，经数年的流行已可引起大批死亡[7-10]。

2006年2月，山西省阳泉市某种鸡场暴发AIV疫情，严格执行免疫程序、抗体水平较高的免疫鸡群中出现短时间内的大量死亡。这与之前其他省份的H5N1亚型HPAI疫情发生情况有所不同。在对该病毒各基因的遗传进化及抗原性系统分析后发现，其与近年来引起我国同亚型疫情的病毒同源率差异较大，并具有抗原变异性，定为“山西鸡型”抗原变异株。随后的疫情诊断及流行病学调查数据表明，该“山西鸡型”抗原变异病毒广泛流行于山西、宁夏等省的免疫鸡群，引起产蛋大幅下降和高达30%的死亡率。目前，该亚群病毒尚未在水禽中分离到，其在鸭中的传播方式和进化特点尚不清楚。本实验通过研究H5N1亚型山西亚群代表毒株CK/SX/2/06(H5N1)在鸭和鸭胚中的感染和致病性，旨在了解山西亚群H5N1亚型HPAIV对鸭的感染和致病能力，以便更好地预防AI的暴发。

1 材料和方法

1.1 病毒株及病毒制备 AIV株A/chicken/Shanxi/2/2006(H5N1)(CK/SX/2/06(H5N1))由国家禽流感参考实验室分离鉴定并保存。将病毒倍比稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，37℃孵化48 h，收集尿囊液，-70℃保存备用。

1.2 实验动物 10日龄SPF鸡胚、鸭胚、3周龄SPF鸭由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，所有动物感染试验均在禽病感染实验室负压隔离器中进行。

1.3 主要试剂 RNA提取试剂TRIzol LS、鼠源反转录酶(MLV)、RNA酶抑制剂(Ribonulease inhibitor,RNasin)均购自Invitogen公司。Taq聚合酶、DNA Marker DL2000购自宝生物工程(大连)有限公司。DNA胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司。测序反应体系CEQTMDTCS-Quick Start Kit购自Beckman公司，引物由上海博亚生物工程公司合成。

1.4 3周龄SPF鸭的继代感染试验 PBS稀释病毒至107EID50/mL。以1 mL/只的剂量(鼻腔0.2 mL、气管0.2 mL、眼0.1 mL、泄殖腔0.5 mL)接种8只3周龄SPF鸭，于感染后第2 d放入5只同群鸭作为同居对照。分别于感染后3 d、5 d采集喉头与泄殖腔拭子并在第3 d从接种组中随机选取3只鸭剖杀，无菌采集脑、气管、肺脏、胸腺、脾脏、盲肠、扁桃体、肾脏、胰腺、肌肉和法氏囊等组织器官用于病毒滴定，以此来作为衡量病毒在鸭体内组织嗜性的标准。从各脏器分离的病毒中，选择血凝价最高的尿囊液收取，测定EID50并作为子代病毒(D-F1)用于继代感染。

1.4.1 鸭感染各代次病毒后各组织器官的病毒滴定对各代次采集的组织器官进行病毒滴定。病料组织称重后，按10%(W/V)的比例加入PBS，充分研磨，4℃下8 000 r/min离心5 min，吸取上清液，用PBS进行10倍倍比稀释，将不同稀释度(100～103)的稀释液分别经尿囊腔接种3枚10日龄SPF鸡胚，37℃孵化48 h，通过检测接种鸡胚尿囊液的血凝活性(HA)来判断其是否感染病毒。

1.4.2 鸭感染各代次病毒后喉头、泄殖腔拭子的病毒滴定 鸭感染各代次病毒后3 d、5 d采集拭子，每组采集喉头和泄殖腔棉拭子各1份。用PBS进行10倍倍比稀释，将不同稀释度(100～103)的稀释液分别经尿囊腔接种3枚10日龄SPF鸡胚，37℃孵化48 h，通过检测接种鸡胚尿囊液的HA活性来判断其是否感染病毒。

1.5 1日龄SPF鸭的感染试验 用PBS稀释病毒至 107EID50/mL。鼻腔 0.2 mL/只接种 5只 1日龄SPF雏鸭，感染后2 d放入5只同群鸭作为同居对照。21 d后采集血液，血凝抑制(HI)试验检测血清抗体转阳水平。

1.6 10日龄～25日龄SPF鸭胚的感染试验 种毒用PBS做 10倍倍比稀释，将 101、103、105、1074个稀释度的病毒分别接种3枚10日龄～25日龄SPF鸭胚，0.1 mL/胚，37℃孵化72 h，每24 h照胚1次，统计鸭胚死亡数量。接种后存活的鸭胚，待其出壳后于隔离器中饲养，21 d后采集血液，HI试验检测血清抗体转阳水平。

1.7 10日龄SPF鸭胚的继代感染及F5代病毒(E-F5)对3周龄鸭的感染试验 种毒用PBS做10倍倍比稀释，将103～10108个稀释度的病毒分别接种3枚10日龄SPF鸭胚，0.1 mL/胚，选取接种病毒稀释度最高并且血凝价最高的感染尿囊液，作为传代病毒接种下批鸭胚。感染5代，将E-F5接种3周龄SPF鸭，方法同1.4，观察病毒对鸭的致病性。

1.8 基因测序与分析 用TRIzol自尿囊液提取病毒RNA，以保守12 bp引物(反转录引物序列：5'-A GCAAAAGCAGG-3')反转录成cDNA。然后以各节段特异性引物进行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃5 min；94℃ 1 min、53℃ 1 min、72℃ 2 min，35个循环。各节段扩增引物略(有需要者笔者可以提供)。电泳鉴定后回收纯化。采用CEQTM8000测序仪以特异性测序引物进行核苷酸序列测定。应用DNAStar及Gene.doc分析软件包中的Seqman进行序列拼接，同时应用Editseq软件进行核苷酸序列分析，应用MegAlign软件对测定的各代次病毒的HA基因进行氨基酸序列比对。

2 结 果

2.1 3周龄SPF鸭的继代感染试验 经鸭体传代的3个代次的病毒D-F1、D-F2和D-F3接种3周龄SPF鸭，除D-F1代病毒接种后第5d感染鸭的喉头和泄殖腔分别有2/5和1/5排毒，其他代次病毒接种后第3 d和第5 d喉头和泄殖腔两途径均未检测到病毒；接种鸭均未表现临床症状，表明病毒对鸭呈低致病性。感染后21 d，接种3个代次病毒的接种鸭分别有3/5、4/5及4/5的抗体转阳，表明病毒能够感染鸭并引起体液免疫反应，但也有少部分鸭无抗体产生。同居组的5只鸭喉头和泄殖腔两种途径均未检测到病毒，并且21 d后无抗体转阳，表明病毒无水平传播能力(表1)。各代次病毒感染3周龄SPF鸭后，能够在气管、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、盲肠扁桃体和法氏囊等组织器官中复制，但复制能力较弱；而在脑、肌肉和胸腺中则未分离到病毒。各代次病毒接种鸭后，每代只有约1/3接种鸭的脏器中检测到病毒，而且病毒含量较低(表2)。

表1 各代次病毒接种鸭后第3 d、5 d排毒检测Table 1 Virus shedding detection of ducks on day 3 and 5 post viruses infection

表2 各代次病毒在鸭组织器官的复制检测Table 2 Virus detection in tissues of ducks infected with the virus

2.2 1日龄SPF鸭的感染实验 1日龄雏鸭接种病毒后接种组和同居组的鸭均无临床症状，而且喉头、泄殖腔拭子中只有少部分检测到病毒。21 d后接种组鸭的血清抗体均呈阳性，而同居组鸭的血清抗体均为阴性(表3)，表明病毒能够感染1日龄雏鸭但仍呈低致病性。

表3 1日龄雏鸭接种病毒后第3 d、5 d排毒检测Table 3 Virus shedding detection in 1-day-old ducks post infection on day 3 and 5

2.3 病毒对不同日龄鸭胚的感染与致病力比较 不同剂量的病毒按常规方法接种10日龄～25日龄鸭胚，结果显示病毒可以感染10日龄～23日龄鸭胚并致死。随着鸭胚日龄的增长，接种不同剂量病毒的鸭胚死亡时间均逐渐推迟。10日龄鸭胚以101～105稀释度的剂量接种，24 h内全部死亡。而21日龄、23日龄鸭胚在接种各剂量病毒后，死亡时间推迟至48 h～72 h。25日龄后鸭胚接种各种剂量后均不致死。接种病毒而存活的鸭胚孵育出壳后，21 d检测血清抗体，结果表明：101、103倍稀释的剂量组，血清抗体呈阳性，而105、107倍稀释的剂量组，血清抗体呈阴性。表明25日龄鸭胚在接种较大剂量的病毒时，可以感染病毒但不致死，而当接种的病毒剂量较小时，鸭胚不感染病毒。

2.4 10日龄SPF鸭胚的继代感染及E-F5对3周龄鸭的感染试验 在10日龄的鸭胚中经过5次继代感染，病毒在鸭胚中繁殖的血凝价逐渐升高。将E-F5接种3周龄鸭，接种后第3 d有1只鸭的喉头拭子中检测到病毒；此外，接种鸭在第3 d、第5 d喉头和泄殖腔两种途径均未检测到病毒；接种后21 d接种鸭抗体全部转阳，但未有任何临床症状，表明病毒对鸭仍呈低致病性。同居组的5只鸭喉头和泄殖腔两种途径均未检测到病毒，并且21 d后无抗体转阳，表明未感染病毒(表4)。

表4 3周龄鸭接种鸭胚传代E-F5后排毒检测Table 4 Virus shedding detection in 3-week-old ducks post infected with E-F5 on day 3 and 5

2.5 基因测序与分析 对3周龄鸭和10日龄鸭胚的继代感染后所获得的病毒D-F3与E-F5的HA基因进行序列测定，并与原代病毒F1进行关键位点的氨基酸序列分析，结果表明D-F3、E-F5与F1比较，HA基因的关键氨基酸位点未发生突变，裂解位点仍为对鸡呈高致病性的-RRKKR-，潜在糖基化位点与受体结合位点亦未发生变化，经过鸭体及鸭胚的连续传代，病毒在序列上保持相对的稳定。

3 讨 论

“山西鸡型”抗原变异株，因其与我国之前分离的同亚型病毒同源性差异较大，并能引起免疫鸡群发病，对家禽养殖业危害很大。虽然目前该亚群病毒只在鸡群中流行，但通过自然进化，同亚型病毒已经对鸭致病性有所增强[6]，山西亚群病毒也具有获得对鸭高致病性的潜在可能。而由于该亚群病毒在基因水平和抗原性上同以往病毒存在较大的差异，该病毒的进化可能对养殖业以至公共安全造成更大的威胁。

在本研究中，鸭的感染实验结果表明病毒目前对鸭的致病力较弱，并且不具备水平传播能力。在对鸭和鸭胚的继代感染中，各代次病毒的HA基因保持遗传稳定，氨基酸位点未发生突变，其对鸭的致病性也一直维持在较低水平。

在病毒对鸭胚的感染研究中，我们发现该病毒虽然不能致死3周龄鸭甚至1日龄的雏鸭，但能致死日龄在25日内的鸭胚，而且病毒对鸭胚的致病力随着鸭胚日龄的增长呈逐渐下降的趋势。其中以23日龄作为鸭胚同时出现各种感染状态的临界日龄，在鸭胚接种病毒后呈现出一种高剂量致死、中等剂量感染但不致死、低剂量不感染的情况。而25日龄鸭胚只表现为高剂量接种感染但不致死和低剂量接种不感染两种情况。病毒能够致死10日龄～23日龄的鸭胚，表明该病毒对以鸭为代表的水禽存在潜在的致死可能。而针对不同日龄鸭胚对病毒感染的反应各异，尤其是23日龄、25日龄鸭胚中出现的感染病毒但不致死的情况，我们推测，鸭胚在发育成熟的过程中，在邻近出壳的几天内发育成熟的某些组织器官(如免疫器官)或腺体，能够有效地抑制病毒在体内的复制。而这种鸭胚日龄影响病毒感染的机制有待于进一步的深入研究。

通过本实验，我们可以推测，由于山西亚群病毒对成年鸭的感染能力较差，病毒排放水平较低，而且在3周龄鸭的继代感染中HA基因在序列上保持稳定，病毒通过在鸭群内的长期携带或水平传播过程中自然进化的可能性不大。但我国鸡、鸭混养的情况比较普遍，存在着病毒在鸡、鸭之间连续横向传播的可能。而病毒能感染并致死10日龄～23日龄鸭胚的事实，表明本病毒不能致死成年鸭这一宿主限制非常脆弱，有很大的突破可能。由于本亚群病毒在基因序列和抗原性上与我国之前流行毒株间存在较大的差异性，因此一旦病毒在进化过程中突破了这种限制，将对我国的疫情控制和免疫防制工作带来巨大影响，甚至对公共安全构成威胁。

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