犬瘟热病毒F1蛋白的原核表达及其抗原性分析

江 勇，姜 骞，林 欢，刘家森，郭东春，韩凌霞，司昌德，曲连东*

(1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001)

犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)属于副粘病毒科麻疹病毒属，该病毒宿主范围广泛，主要引起犬科、鼬科和浣熊科动物的急性、高度接触传染性疾病，以及感染野生猫科动物、环颈野猪类和西伯利亚海豹等，病死率高达100%。CDV已成为当前危害养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业主要病原之一[1-4]。因此，对犬瘟热进行早期确诊、流行病学监测及新型疫苗研制对该病的预防及控制具有重要意义。

F1蛋白相对保守，对病毒的膜融合起关键作用[5]，其HRA区和HRB区相应的合成肽免疫动物具有抑制病毒感染的能力[6]。研究显示，台湾地区流行毒株的F1蛋白氨基酸序列的同源性高达99%[7]，提示F1蛋白可作为CDV诊断的候选抗原。同时，F1蛋白还含有一些辅助性T细胞抗原表位，可引起特异性的细胞免疫应答[8]。因此，本研究表达了F1蛋白，为进一步建立检测CDV抗体间接ELISA方法及研制F1蛋白亚单位疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株及主要试剂 CDV HLJ2-07株由本实验室分离保存；兔抗CDV阳性血清、犬抗CDV标准阳性血清、阴性血清，犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬传染性肝炎(CHV)、犬波特氏杆菌(CBb)阳性血清均为本实验室制备；E.coliTop10、BL21(DE3)感受态细胞及pET-30a(+)表达载体由本实验室保存；First-Strand cDNA Synthesis Using SuperScriptTMⅡ Reverse Transcriptase购自 Invitrogen公司；pMD18-T和限制性内切酶购自TaKaRa公司；荧光羊抗兔IgG购自Sigma公司；辣根过氧化物酶标记羊抗犬IgG购自KPL公司。

1.2 引物设计 根据GenBank登录的F1基因序列(EF445055)，设计一对引物：Up：5'-TTGAATCCCA GATACATTGGAATAA-3'；Low：5'-ATACTCGAGA CGCCTTTGTCTCCTACC-3'。

1.3 目的基因扩增 参照TRIzol LS Reagent说明书提取CDV的总RNA，参照Invitrogen公司试剂盒说明书进行逆转录反应。取逆转录产物(cDNA)，经PCR扩增目的片段，反应程序：95℃5 min；94℃30 s、51.7℃ 30 s、72℃ 1.5 min，共30个循环；72℃10 min。对产物进行胶回收。

1.4 重组表达质粒pET-F1的构建 将F1基因PCR产物与pMD18-T连接，转化Top10感受态细胞，提取质粒，经酶切鉴定筛选阳性克隆、测序。测序正确的重组质粒及用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，纯化后连接到经同样双酶切纯化的pET-30a(+)载体，构建重组表达质粒pET-F1。

1.5 重组蛋白的诱导表达、纯化及可溶性分析 将pET-F1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37℃振荡培养至OD600nm值达0.6时，经IPTG诱导进行表达。表达产物进行SDS-PAGE分析。参照Promega公司MagneHisTMProtein Purification System说明书，进行重组蛋白的纯化。

1.6 重组蛋白的western blot鉴定 纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳并转膜，以大肠杆菌吸附处理的兔抗CDV阳性血清为一抗，荧光羊抗兔IgG为二抗，用红外扫描成像系统获取图像。

1.7 特异性鉴定 以重组蛋白为抗原，采用方阵试验确定抗原包被浓度及血清工作浓度，辣根过氧化物酶标记羊抗犬IgG以1∶10 000稀释，TMB显色。(结果判定：阳性血清OD450nm值1.00以上，阴性血清OD450nm值0.20以下，P/N值最大)。采用该ELISA检测方法对CPV、CPIV、CHV、CBb阳性血清进行特异性检测，同时设阴性和阳性对照。

2 结果与讨论

2.1 目的基因扩增及重组表达质粒pET-F1的构建以CDV cDNA为模板，通过PCR扩增，获得扩增片段约为1 300 bp，与预期大小相符。测序结果表明其序列与参考毒株的F1基因序列完全一致。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pET-F1，分别得到约5 400 bp和1 300 bp的片段，酶切鉴定与预期相符。

2.2 重组蛋白SDS-PAGE分析 重组菌诱导后在约47.5 ku处出现蛋白条带，与预期重组蛋白分子量一致(图1)。对裂解诱导表达菌体，进一步分析结果显示：大部分重组蛋白存于裂解菌沉淀中，表明重组蛋白以包涵体形式存在。薄层扫描结果显示，重组蛋白占菌体总蛋白31.5%。

2.3 重组蛋白western blot鉴定 以CDV阳性血清进行western blot检测，结果显示，重组蛋白在约47.5 ku处出现特异性目的条带(图2)，表明重组蛋白可以与CDV阳性血清发生反应，并具有良好的抗原性。

2.4 特异性鉴定 将纯化的F1重组蛋白作为包被抗原，经方阵试验确定抗原最佳包被量为4.2 ng/孔，血清最佳稀释度为1∶200。以建立的ELISA方法检测犬的4种病原的阳性血清，结果显示，其P/N值均小于2.0(表1)，表明重组蛋白具有良好特异性。

表1 ELISA检测的特异性试验Table 1 The specificity assay of F1 protein by ELISA

本研究利用原核表达系统表达目的蛋白，已知pET-30a(+)载体的标签蛋白大小约为7.5 ku，F1基因编码蛋白大小约为40 ku，这与本研究所获取的重组蛋白大小约为47.5 ku一致，为纯化重组蛋白。本实验采用纯化试剂盒，最初以pH7.8的8 mol/L尿素裂解重组蛋白，但效果不理想，未得到目的蛋白。优化后改用pH8.5的蛋白裂解液，最终纯化到目的蛋白。分析原因可能为：经DNAStar软件推测的重组蛋白等电点为7.9，接近蛋白裂解液pH值而成中性，蛋白发生聚集沉淀。将裂解液pH值改为8.5后，重组蛋白带负电，远离等电点而溶解，而镍离子亲和树脂带正电，增加了蛋白与树脂之间的亲和力，利于蛋白纯化。

随着病毒的变异，近几年犬瘟热的发病率又有显著增长。基因工程疫苗以其安全高效等特点被广泛应用于疾病的预防。本研究中HLJ2-07株F1基因核苷酸序列、氨基酸序列与国内流行毒株进行比对，同源性均很高。制备的F1重组蛋白具有良好的抗原性，为F1蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。

目前，国内已有应用重组N蛋白作为诊断抗原，建立检测CDV抗体间接ELISA方法的报道[9]，闫芳等表达了F1蛋白片段并将其作为CDV的诊断抗原[10]。本研究制备的F1重组蛋白保留了跨膜区，结构更加完整，并初步建立了检测CDV抗体的间接ELISA方法，可为CDV感染过程中抗体监测提供有效手段，也为犬瘟热早期诊断、流行病学调查等研究奠定了基础。

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