副猪嗜血杆菌黏附基因的表达和免疫原性鉴定

耿 屹，曹荣峰，高晓宇，李守军*，张桂红*

(1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109；3.华南农业大学兽医学院，广东广州510642)

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是猪上呼吸道的一种常在的条件性致病菌，可引起猪的纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的革拉瑟氏病(GIasser's disease)[1-2]。HPS是一种NAD依赖型、不运动的革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德菌科(Pastteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus)。该菌多与其他病原，如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染，严重危害仔猪和青年猪的健康[3]。近年来由于该病的频繁发生，给养猪业造成严重的损失，因此倍受人们的关注。

HPS主要存在于猪的上呼吸道(鼻腔、扁桃体和气管前段)内[4]。许多HPS菌株具有类似于菌毛的丝状结构，菌毛是上呼吸道黏附因子，黏附后发生侵袭，进入体内[5]，虽然HPS和宿主之间的相互作用还不清楚，但黏附到宿主组织是感染开始时最关键的一步，因此阻断感染的初始阶段，特别是黏附到细胞和定植在黏膜表面，可能是预防感染最有效的策略。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒和细胞 HPS由华南农业大学兽医学院禽病研究室提供；猪HPS阳性血清由华中农业大学惠赠。HRP兔抗猪酶标二抗购自北京博尔森公司。大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α及质粒pET-32a(+)为本实验室保存。

1.2 主要试剂 各种DNA限制性内切酶、T4连接酶、TaqDNA聚合酶、标准相对分子质量Marker均购自TaKaRa公司。DNA胶回收试剂盒和低相对分子质量标准蛋白购自上海生工生物工程公司。硝酸纤维素(NC)膜为Whatmen公司产品；化学发光底物试剂盒为Pierce公司产品。His·Bind纯化试剂盒购自Novagen公司。

1.3 引物的设计和黏附素(adhesin)基因的扩增根据GenBank中登录的HPS基因序列(NZ_ABKM01000110)设计PCR扩增引物。引物序列为：5'-GATATCATGAACAAGGATTTAACGAAC-3'和5'-AAGCTTCTACCACTGATA ACCTACCCC-3'。划线部分为EcoRⅤ和HindⅢ酶切位点，由上海生工生物工程公司合成，扩增片段长度为1 440 bp。以HPS DNA为模板，进行常规PCR扩增，循环参数：95℃ 5 min；94℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 45 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 pET-adhesin表达重组质粒构建 将回收纯化的adhesin PCR产物和pET-32a(+)分别用EcoRⅤ和HindⅢ酶切后，从琼脂糖凝胶回收pET-32a(+)和PCR产物，连接，分别转化DH5α和BL21(DE3)。挑取单菌落培养，提取重组质粒酶切鉴定，并由上海生工生物工程公司测序。

1.5 重组蛋白adhesin的诱导表达 将含pET-adhesin的阳性重组菌按1∶100稀释，37℃，220 r/min培养4 h，菌液OD600nm值为0.8时，加入IPTG。为了获得理想的表达量，分别对IPTG浓度(0.2 mmol/L～1.0 mmol/L)以及诱导时间(1 h～6 h)进行优化。将重组菌裂解物进行SDS-PAGE电泳分析。

1.6 重组蛋白纯化 重组蛋白的纯化按照Novagen公司的His·Bind Kits说明书进行。

1.7 重组蛋白western blot分析 蛋白SDS-PAGE电泳后，电转印至NC膜上。将膜4℃封闭过夜。以HPS阳性血清为一抗，兔抗猪IgG-HRP为二抗，对重组蛋白进行western blot检测分析。

2 结果与讨论

2.1 Adhesin基因的扩增 以HPS的DNA为模板，对Adhesin基因进行PCR扩增，其产物片段约1400bp，与预期大小(1 440 bp)相符(图1)。

2.2 重组表达载体pET-adhesin的鉴定 PCR产物用HindⅢ和EcoRⅤ酶切后，与用相同酶切得pET-32a(+)连接得到重组质粒pET-adhesin转化大肠杆菌BL21后，提取质粒经HindⅢ和EcoRⅤ双酶切和测序鉴定，结果表明基因插入正确。

2.3 重组蛋白的诱导表达及诱导条件的优化SDS-PAGE电泳分析表明，出现一条约60 ku的蛋白条带，与预期蛋白的分子量(59.5 ku)的理论值相符，而对照无此条带。蛋白分别在0.6 mol/L的IPTG和5 h时表达量达到最大(图2)。

2.4 重组蛋白可溶性分析、纯化及western blot分析 裂解诱导表达菌体，对表达蛋白进行进一步分析，结果显示大部分表达蛋白存在于裂解菌的沉淀中，表明表达的重组蛋白在菌体内未能正确折叠，出现了蛋白聚集的现象，主要以包涵体形式存在(图2)。

纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳，可见一条清晰的蛋白条带，表明表达产物的纯化良好(图3)。纯化产物的western blot分析可见在59.5 ku处出现明显的棕色印迹，而阴性对照无此条带(图4)。表明目的基因在大肠杆菌BL21中得到正确表达，表达产物能够被HPS阳性血清所识别，具有良好的反应原性。

目前，控制HPS感染的主要手段是商品疫苗[6]或自家疫苗[7]，虽获得了不同程度的保护作用，但仍不理想。HPS血清型的多样性以及占很大比例的不能分型的菌株影响了对具有高效交叉保护力疫苗的研制。近年来，黏附素在细菌发病中的作用及其在诊断治疗中的应用已经引起较多的关注，但在国内尚是空白，有关细菌黏附素的研究也鲜有报道。

本研究参照HPS adhesin基因序列，设计引物扩增adhesin基因的编码区，经测序鉴定扩增序列正确的载体连接，从而保证能够表达出高度一致正确的蛋白。本研究在大肠杆菌中获得了高效表达的重组蛋白，表达蛋白以包涵体形式存在。SDS-PAGE电泳显示表达产物与预测的蛋白大小相吻合。纯化的蛋白经western blot检测，与HPS阳性血清反应，显示具有一定的免疫学活性，可以作为良好的疫苗候选抗原，但其是否具有免疫防治作用还有待进一步的研究。

[1]Oliveira S,Pijoan C.Computer-based analysis ofHaemophilus parasuisprotein fingerprints[J].Can J Vet Res,2004,68:71-75.

[2]Oliveira S,Pijoan C.Haemophilus parasuis:new trends on diagnosis,epidemiology and control[J].Vet Microbiol,2004,99:1-12.

[3]Kim J,Chung H K,Jung T,et al.Postweaning multisystemic wasting syndrome of pigs in Korea:prevalence,microscopic lesions and coexisting microorganisms[J].J Vet Med Sci,2002,64(1):57262.

[4]万遂如.养猪专业户饲养种猪的免疫预防[J].养猪，2005(1)：40-41.

[5]潘玲，吴信法.细菌的黏附与黏附素[J].畜牧与兽医，1997，29(2)：85-88.

[6]Baumann G,Bilkei G.Effect of vaccinating sows and their piglets on the development of Glasser's disease induced by a virulent strain ofHaemophilus parasuis[J].Vet Rec,2002,151:18-21.

[7]Kirkwood R N,Rawluk S A,Cegielski A C,et al.Effect of pig age and autogenous sow vaccination on nasal mucosal colonization of pigs byHaemophilus parasuis[J].J Swine Health Prod,2001,9:77-79.