结肠癌组织中Toll样受体4基因表达

黄宏耀 陈巍巍 张秋莹 刘方方 邓 涛 谢圣高

肿 瘤细胞表面存在 Toll样受体(Toll-like receptor,TLR),它有 10余个家族成员,属于 I型跨膜蛋白,可通过识别相关病原的分子模式及某些内源性配体引发信号传导和炎症介质释放。研究证实Toll样受体4(TLR-4)可介导肿瘤细胞的免疫逃逸和浸润功能。本文应用实时荧光定量PCR(Realtime PCR)检测结肠癌及癌旁组织中TLR-4 mRNA水平,为TLR-4基因表达与结肠癌发生、发展、浸润、转移的关系研究提供资料。

1 资料与方法

1.1 材料

63例结肠癌组织及其癌旁正常组织(距离肉眼可见的癌组织≥2cm以上取材)组织标本来自本院2006年2月至2009年3月间结肠癌手术患者,均经组织病理学确诊,癌旁正常组织经过病理检测无癌细胞浸润,病例均未经过放、化疗,其中男女性各为37、26例,有无淋巴结转移各为 27、36例,高、中、低分化各为 23、17、20 例;Dukes'A 、B、C、D 期各为 18、14、22、9 例。

1.2 试剂与仪器

TLR-4引物:上游:5'-AGCCACCTCTCTACCTTAATATTGA-3',下游:3'-CCGAGTGTTA GAATAG GTTAGAAA G-5',Prism?7900型荧光定量 PCR仪(ABI,美国),Trizol Reagent(Invitrogen,美国),反转录试剂盒(TOYOBO,日本),荧光染料Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI,美国)。

1.3 cDNA制备和荧光定量PCR方法

所有结肠癌组织和癌旁正常组织均分别按照 Trizol试剂说明书提取总RNA,然后根据反转录试剂说明将总RNA逆转录成cDNA。Realtime PCR体系为25μl,按照下列顺序依次加入反转录产物、上游引物、下游引物各、荧光染料共12.5μl至 EP管中,补水至总体积25μl,同时制作标准品曲线。PCR反应程序为 95℃变性 5 min,94℃、60℃、72℃各20s,55个循环后,72℃保温5 min,55℃10s。每样本设置3个平行孔,取拷贝数均值进行统计分析。

1.4 统计学处理

各组Realtime PCR结果根据标准曲线读取,以绝对定量数值表示,用SPSS 12.0统计软件得出均数±标准差(±s),组间差异比较采用方差分析t检验,P＜0.05为有显著性统计学意义。

2 结 果

结肠癌组织TLR-4m RNA表达量明显高于癌旁组织(P＜0.01)。低分化型结肠癌高于高、中分化结肠癌(P＜0.01)。有淋巴结转移者与无淋巴结转移者 TLR-4mRNA表达量差异无显著性(P＞0.05)。Dukes'A期 TLR-4mRNA表达量低于B、C、D期(P＜0.01),B、C、D期之间差异无显著性(P＞0.05)。见表1。

表1 结肠癌患者TLR-4mRNA表达结果比较(±s)

表1 结肠癌患者TLR-4mRNA表达结果比较(±s)

注:与癌旁组织比较,1)P＜0.01;与高、中分化结肠癌比较,2)P＜0.01;与Dukes'A期结肠癌比较,3)P＜0.01

n TLR4 mRNA拷贝数结肠癌 63 86.42±15.161)癌旁组织 63 32.74±9.44高分化结肠癌 23 69.58±11.27中分化结肠癌 17 64.57±13.91低分化结肠癌 20 97.12±15.442)结肠癌伴淋巴结转移 27 89.91±13.22结肠癌不伴淋巴结转移 36 81.16±13.59 Dukes'A期结肠癌 18 59.05±11.66 Dukes'B期结肠癌 14 92.32±17.513)Dukes'C期结肠癌 22 91.41±15.213)Dukes'D期结肠癌 9 101.46±17.343)

3 讨 论

研究证实,肿瘤细胞尤其是上皮源性肿瘤细胞表面存在TLR,其在肿瘤的发病机制和生物免疫治疗中可能起到一定的作用。TLR可被存在于局部的相应配体激活,启动上皮细胞的恶性表型转化,同时分泌细胞因子,刺激肿瘤细胞生长。TLR-4信号途径的持续激活被认为是慢性炎症持续存在进而发展为恶性肿瘤的重要原因[1,2]。

本文结果表明63例结肠癌组织中TLR-4 mRNA的表达比邻近正常结肠组织明显升高,提示TLR-4基因高表达可能参与了结肠癌的发生发展,其机制与TLR-4介导肿瘤细胞的免疫逃逸和浸润功能有关,结肠癌细胞本身或者其释放的细胞因子作为TLR-4配体发挥作用,激活 TLR-4,上调TLR-4 m RNA水平,通过一系列信号途径,诱发结肠癌。近来在肺癌、喉癌的研究中也发现,TLR-4在癌细胞或浸润炎症细胞上的高表达与肿瘤的免疫逃逸密切相关[3,4]。

本文结果显示低分化型(包括Dukes'B、C、D期)结肠癌TLR-4m RNA明显高于高、中分化(Dukes'A期)结肠癌,且从高分化到低分化表现为渐进性上升,提示TLR-4参与了结肠癌的分化进程。但结肠癌淋巴转移与否的TLR-4mRNA表达没有明显差异,提示TLR-4基因表达水平高低不能区分结肠癌是否经淋巴转移。

1 Bauera K,Dixon D,Degraff L M,et al.Toll-lik e receptor 4 in buty latod hydroxytoluene-induced mouse pulmonary inflammation and tumorigenesis.J Nail Cancer Inst,2005,97(23):1 778～1 781.

2 Ishida I,Kubo H,Suzuki S,et al.Hypoxia diminishes Toll-like receptor 4 expression through reactive oxygen species generated by mitochondfia in endothelial ceils.J Immunol,2002,169(4);2 069～2 075.

3 He W,Liu Q,Wang L,et al.TLR4 signaling promotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Mol Immunol,2007,44(11):2 850～2 859.

4 Szczepański M,Stelmachowska M,Stryczyński L,et al.Assessment of expression of toll-like receptors 2,3 and 4 in laryngeal carcinoma.EurArch Otorhinolaryngol,2007,264(5):525～530.