香烟提取物和脂多糖对小鼠肺上皮细胞株MLE-12活性及水通道蛋白5 mRNA表达的影响

金常娥 甄国华 徐永健 刘 建 康冠楠 王树娟

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是危害人类健康的常见病。引起COPD的一个重要原因为吸烟,吸烟可以激活支气管上皮组织、巨噬细胞、中性粒细胞,导致它们分泌释放蛋白酶和氧自由基等,从而破坏支气管和肺泡。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分,为脂质和多糖的复合物,被认为是微生物(细菌)感染后的强有力的炎症始动因素,它可以直接引起呼吸道上皮损伤,导致慢性呼吸道炎症。在香烟提取物(CSE)和 LPS两者同时作用下,更多的细菌定植于呼吸道,持续的气道炎症导致气道壁损伤和重构、粘液增生、胶原含量增加,最后引起气流受限,促进COPD的发生和发展。这也可能就是COPD患者病情发生和发展的重要原因。本研究旨在观察CSE和LPS刺激后小鼠肺上皮细胞MLE-12水通道蛋白5(AQP5)的表达,并初步评价其在COPD中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:试验所用细胞为小鼠肺上皮细胞株MLE-12(ATCC,美国)

1.1.2 主要试剂:DMEM/F12培养基、胎牛血清(Gibco公司,美国);PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa 公司 ,日本);焦碳酸二乙酯(DEPC)(Amresco公司,美国);T rizol试剂(Invitrogen公司,美国);脂多糖(LPS)(Sigma公司,美国);香烟自购。

1.1.3 主要仪器:CO2培养箱(NUAIRE,美国);超净工作台(CX-102型,安徽蚌埠净化设备厂);倒置相差显微镜、Rotor-Gene荧光实时定量 PCR仪(Corbett公司,澳大利亚)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肺上皮细胞MLE12的培养:小鼠肺上皮细胞MLE12生长于10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基中,在37℃、5%CO2的条件下培养,每2～3天传代一次,每次传代比例为1:3～1:5。

1.2.2 香烟提取物(CSE)的制备:将市售某牌香烟(烤烟型,每支香烟焦油含量为17 mg,烟气烟碱含量为112 mg)点燃,其过滤嘴端接一根橡皮管,橡皮管的另一端接注射器。点燃香烟,每次吸50ml,共收集12管600ml烟雾,将烟雾注入含25ml PBS的玻璃瓶中,摇晃玻璃瓶使烟雾溶入 PBS中,即为100%原液,实验前用0.22μ m微孔滤膜过滤去除细菌和大颗粒。CSE均于使用前30min制备。CSE浓度用终容积中CSE原液的百分比表示。

1.2.3 CSE和LPS毒性试验:CSE毒性试验分为CSE组和CSE+LPS组,在贴壁生长于96孔板的小鼠肺上皮细胞株MLE-12细胞中,CSE组每孔加入200μ l含不同CSE浓度(2.5%、5%、10%、15%、20%)的含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,CSE+LPS组每孔同时加入20μ g/ml的LPS和不同浓度的CSE(同CSE组)。LPS毒性试验分为LPS组和LPS+CSE组,LPS组每孔加入不同浓度LPS(2.5μ g/ml、5μ g/ml、10μ g/ml、15μ g/ml、20μ g/ml),LPS+CSE组每孔同时加入10%CSE和不同浓度的LPS(同LPS组)。以上四组细胞每种浓度设3个复孔,并设不加CSE和LPS的空白对照孔,培养24h后每孔加入5mg/ml的四甲基偶氮唑盐(MT T)20μ l,孵育 4h,1 500r/min 离心 10min,弃上清,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μ l,摇匀,用ELISA免疫酶标仪(570 nm)测定各孔培养液OD值。取各浓度平均OD值分别计算细胞活性。细胞活性(%)=(试验孔OD值/对照孔OD值)×100%。

1.2.4 细胞分组和刺激试验:刺激前一天,培养细胞用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化后,接种于6孔培养板上(接种密度为2.0×105cells/孔),细胞贴壁后进行刺激试验。试验分为四组(对照组、CSE组、LPS组、CSE+LPS组),后三组分别用 10%CSE 、20μ g/ml LPS 、10%CSE+20μ g/ml LPS,对照组用完全培养基培养24h。每组3孔,重复3次。

1.2.5 荧光实时定量PCR检测AQP5mRNA的表达:上述各组细胞刺激培养24h后,用 Trizol一步法提取总RNA。紫外分光光度计测定RNA浓度,按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA,20μ l体系加入1μ g总RNA。实时定量PCR按照说明书操作,反应体系为20μ l,分别加入双蒸水7.2μ l、10μ M 的 上 下 游 引 物 各 0.4μ l、SYBR?Premix Ex TaqTM 10μ l。肌动蛋白 β-actin 为内参照,并设阴性对照。反应条件相同,即预变性95℃,10s;两步法PCR,即变性95℃,10s;延伸 60℃,20s;共40个循环。β-actin上游引物:5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′,下游引物 :5′-GACTCATCGTACTCCTGCT TGCTG-3′;AQP5 上游引物:5′-TTATCCATTGGCTTGTCGGTCA-3′、下游引物 5′-CACGATCGGTCCTACCCAGAA-3′。用双标准曲线法求得目的基因mRNA的相对含量(以β-actin作为内参照而求得相对含量)。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 CSE对肺上皮M LE-12细胞活性的影响

与不含 CSE的对照培养液相比较,肺上皮MLE-12细胞在CSE小于10%时的培养液中细胞活性无明显降低(P＞0.05),当CSE浓度＞10%时各组细胞活性显著降低(P＜0.01),下降约60%。相同CSE浓度下CSE组和 CSE+LPS(20μ g/ml)组之间的细胞活性无明显差别(图1)。而不同浓度的LPS刺激后细胞活性差异不大,LPS组和CSE+LPS组细胞活性均大于90%(图2)。参考相关文献和以上细胞毒性试验结果,本文选用10%CSE和20μ g/ml的LPS作为后续试验的刺激浓度。

图1 CSE对肺上皮细胞活性的影响

图2 LPS对肺上皮细胞活性的影响

2.2 CSE及LPS单独或共刺激肺上皮细胞MLE-12后AQP5 mRNA水平的变化

对照组AQP5 mRNA表达量较高,相对含量为0.95±0.09,CSE组、LPS组AQP5 mRNA表达水平降低,其相对含量分别为0.70±0.13和0.57±0.20,CSE+LPS组AQP5表达水平进一步降低,为0.26±0.07。结果见图3。

3 讨 论

AQPs是一种跨膜水通道家族,广泛表达于上皮和内皮细胞膜上的选择性高效转运水分子的特异孔道[1],介导液体体积和渗透压变化而引起细胞和生理反应。AQPs对于多种组织的正常分泌和吸收功能至关重要,包括眼睛、肺、唾液腺、汗腺、肾脏,并且在调节整个机体的水平衡中发挥重要作用。肺组织表达4种AQPs,其中AQP5高表达在远端肺Ⅰ型肺泡上皮细胞,气道上皮细胞轻微表达[2]。本研究发现,AQP5在MLE-12上表达水平也很高。MLE-12本质上是一种具有Ⅱ型肺泡上皮细胞特征的细胞系[3],由于Ⅱ型肺泡上皮细胞在维持肺泡屏障完整性及肺泡稳定性方面起重要作用[4],可以合成肺泡表面活性物质,具有前体细胞功能,对于维持稳定的正常肺细胞群起重要作用。研究[4]发现Ⅱ型肺泡上皮细胞含有丰富的Na+-K+ATP酶,具有将肺泡液中Na+主动转运到肺间质的能力,对于保持肺泡内相对干燥,维持肺泡腔微循环具有重要作用。此外还有调节表面活性物质代谢、离子转运及损伤后肺组织修复等作用。Ⅱ型肺泡上皮细胞上表达的AQP5,可能参与了其水分子的转运和代谢,从而影响Ⅱ型肺泡上皮细胞各种功能的发挥。

图3 CSE与LPS单独或共刺激MLE-12细胞后AQP5的mRNA水平变化

本研究结果显示,单独用CSE或LPS刺激MLE-12细胞,其AQP5表达水平下降,CSE与LPS共刺激后,AQP5表达水平进一步下降(低于单独用CSE或LPS刺激组)。众所周知,香烟和和呼吸道感染相互作用、相互促进,从而引起COPD的发生和发展,吸烟是引起COPD的主要因素,呼吸道感染被认为是COPD急性加重的主要原因。LPS是一种革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,为脂质和多糖的复合物,被认为是微生物的强有力的炎症始动因素。研究显示与COPD有关的一些致病因素如吸烟、促炎因子、细菌感染可以单独诱导与COPD相关的一些病理变化如粘液分泌增加、持续的炎症反应、氧化应激产物的增加等[5]。而在COPD病人,这些因素常常同时存在。我们的研究结果显示CSE和LPS单独刺激肺上皮细胞株MLE-12可以降低其AQP5的表达,而且CSE可以协同LPS进一步降低AQP5的表达。

研究认为AQP5在调节气-血屏障的水通透性中发挥重要作用,并在调节气道粘膜下腺体Muc5AC粘蛋白分泌中也发挥重要作用[6,7]。本研究表明,CSE协同LPS降低MLE-12细胞上AQP5的表达,可能会引起Muc5AC的合成和分泌增加、支气管反应增强,从而参与COPD的发生和发展。研究表明,肺部炎症性疾病(包括哮喘、COPD)常常以细胞因子表达增加、炎性细胞浸润、过多水聚集或肺水肿为特征[8];小鼠肺炎模型研究表明AQPs的表达下降;对 AQP5基因敲除小鼠的研究发现AQP5在肺脏大部分水转运中发挥重要作用[11]。CSE协同LPS降低M LE-12细胞上AQP5的表达可能有助于解释吸烟和细菌双重作用引起的肺部炎症常常伴随有肺水肿、肺顺应性降低。