氯沙坦钾对糖尿病肾病大鼠主动脉内皮舒张功能的影响

梁 慧,陈还珍,刘锦秀,郎晓青

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常见微血管并发症,是导致糖尿病(DM)患者死亡的重要原因。有研究证实,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在糖尿病肾病发生、发展中起着重要作用,抑制AngⅡ产生并干扰其作用过程是糖尿病肾病治疗的关键[1]。实验性糖尿病动物组织中可以发现AngⅡ增多[2]。AngⅡ与高血糖是血管功能障碍(内皮和平滑肌功能障碍)并发症发生的起始和持续危害因素,可以造成血管收缩的高反应性、胰岛素抵抗及增加氧化应激损伤。氯沙坦是一种血管紧张素Ⅱ1型(AT1)受体拮抗剂,能与AT1R特异结合,阻断 AngⅡ的作用。过去有研究发现糖尿病大鼠用氯沙坦治疗后,可以防止糖尿病所引起的心脏电生理及代谢方面的改变[3]。现已证实内皮衍生舒张因子的化学本质就是一氧化氮,血管内皮功能障碍特征的表现为内皮细胞源性一氧化氮生成减少或活性减低,其生物学效应表现为血管内皮依赖性舒张功能的减弱或消失[4]。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(A RB)已被证实具有保护肾脏、改善血管内皮功能的作用,在临床上也得到应用。本实验进一步探讨氯沙坦对糖尿病肾病大鼠主动脉内皮舒张功能影响及NO含量的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠 30只,体重(150±20)g,购养于山西医科大学实验动物中心,批号:山医字第070101号。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 30只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、氯沙坦钾组,每组各10只。

1.4.2 动物模型制作 30只大鼠适应环境生长1周,除了正常组大鼠外,其余两组用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,切除右侧肾脏。切除肾脏2周后,模型组和氯沙坦钾组一次性腹腔注射STZ(50 mg/kg STZ溶于柠檬酸盐缓冲液,pH值为4.5),而正常组腹腔注射等体积的柠檬酸盐缓冲液(不含STZ,pH为4.5)。注射STZ大鼠,3 d后测大鼠尾静脉血糖,若血糖高于16.7 mmol/L,定为糖尿病模型建立。2周后测定大鼠血糖、24 h尿蛋白。若血糖＞16.7 mmol/L、24 h尿蛋白＞30 mg/(kg◦d)认为DN模型成立[5]。

1.4.3 给药方法 糖尿病肾病大鼠模型制作成功后,氯沙坦钾组每日固定时间给予氯沙坦钾灌胃(20 mg/kg),氯沙坦钾用量的调整依据体质量的变化,维持在每日20 mg/kg,正常组和模型组每日给予等量的生理盐水,实验周期共12周。

1.5 检测方法

1.5.1 血糖、24 h尿蛋白定量及体质量测定 STZ注射3 d起,于第12周末测定正常组、模型组和氯沙坦钾组血糖、24 h尿蛋白定量及体质量。血糖用血糖仪测定大鼠尾静脉方法,采用全自动多功能生化分析仪测定24 h尿蛋白定量。

1.5.2 血管环张力的测定 于大鼠麻醉后开胸,取胸主动脉,清除周围结缔组织,制成3 mm～4 mm长的血管环。将血管环置于37℃血管缓冲液的恒温离体器官灌流浴槽中,并持续充入体积分数为95%的氧气和5%二氧化碳混合气体,使溶液的pH值保持在7.35～7.45,温度保持在(37.0±0.5)℃,预张力设为1 g,平衡1.5 h,期间不断调整张力使之保持在1 g,每20 min换液1次。

1.5.2.1 血管环对去甲肾上腺素(NE)收缩反应性测定 待正常组、模型组与氯沙坦钾组血管环平衡后,向浴槽内加入不同累计浓度的 NE(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L),待张力曲线平稳后,测定不同血管环对不同累积浓度NE反应性。以各浓度引起的收缩幅度占最大收缩幅度的百分比表示血管条片对去甲肾上腺素的反应,并计算引起最大收缩效应一半的药物浓度(EC50)和最大收缩效应(Emax)。

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1.5.2.2 血管环对乙酰胆碱(ACH)舒张反应性测定 用血管缓冲液反复洗脱3次,每20min换液1次,待血管环张力回到1 g,平衡后,每组血管环用10-6mol/L NE预收缩,达最大收缩状态时,再加入不同累积浓度 ACH(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L),记录最大张力值,以血管环对累积浓度乙酰胆碱舒张反应的幅度占血管环对去氧肾上腺素引起的收缩幅度之比,表示血管环对乙酰胆碱的舒张反应,计算引起最大舒张效应一半的药物浓度(IC50)和Emax。

1.5.2.3 血管环对硝普钠舒张反应性测定 同上述洗脱过程,待血管环平衡后,每组血管环用10-6mol/LNE预收缩,达最大收缩状态时,再累积加入不同浓度硝普钠(10-9mol/L、10-8mol/L 、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L),记录最大张力值,用同样于乙酰胆碱舒张反应测定的方法,测定血管环对硝普钠的反应性。

1.5.3 NO含量测定 于第12周末分别取正常组、模型组及氯沙坦钾组大鼠空腹静脉血2 mL,离心、分离血浆,用NO试剂盒,采用硝酸还原酶法测定其含量。

2 结 果

2.1 对大鼠血糖、24 h尿蛋白、体质量的影响 模型组及氯沙坦钾组的血糖、体质量明显高于正常组(P＜0.05),模型组与氯沙坦钾组血糖、体质量差异无统计学意义(P＞0.05)。模型组、氯沙坦钾组24 h尿蛋白定量高于正常组(P＜0.05),氯沙坦钾组24 h尿蛋白定量明显低于模型组(P＜0.05)。详见表1。

表1 3组血糖、尿蛋白定量和体质量比较(±s)

表1 3组血糖、尿蛋白定量和体质量比较(±s)

组别 n 血糖mmol/L 24 h尿蛋白定量mg/24 h体质量g正常组 10 4.46±0.12 14.79±0.23 302.06±0.64模型组 10 21.01±0.211) 94.17±0.621) 321.71±0.321)氯沙坦钾组 10 21.09±0.171) 58.00±0.411)2) 320.29±0.491)与正常组比较,1)P＜0.05;与模型组比较,2)P＜0.05

2.2 血管环对NE收缩反应性的影响(见表2)正常组、模型组及氯沙坦钾组离体血管环对NE的收缩反应性随NE浓度的增加增强。在同一NE浓度下模型组、氯沙坦钾组与正常组收缩反应相似,且差异无统计学意义(P＞0.05)。正常组、模型组及氯沙坦钾组 EC50、Emax差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 3组主动脉血管环对NE收缩反应E50及Emax(±s)

表2 3组主动脉血管环对NE收缩反应E50及Emax(±s)

组别 n EC50(×10-7mol/L)Emax(%)正常组 10 2.47±0.01 75.02±0.07模型组 10 2.50±0.02 75.10±0.11氯沙坦钾组 10 2.48±0.01 75.02±0.07

2.3 血管环对乙酰胆碱舒张反应性影响 模型组、氯沙坦钾组较正常组对Ach的舒张反应性明显降低(P＜0.01)。氯沙坦钾组对Ach舒张反应性明显高于模型组(P＜0.01)。模型组与氯沙坦钾组与正常组IC50及Emax相比差异有统计学意义(P＜0.01),氯沙坦钾组与模型组IC50及Emax比较也有统计学意义(P＜0.01)。详见表 3。

表3 3组大鼠血管环对乙酰胆碱舒张反应IC50及Emax(±s)

表3 3组大鼠血管环对乙酰胆碱舒张反应IC50及Emax(±s)

组别 n IC50(×10-7mol/L)Emax(%)正常组 10 1.80±0.03 64.19±0.06模型组 10 2.57±0.021) 35.97±0.051)氯沙坦钾组 10 2.04±0.041)2) 57.85±0.181)2)与正常组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.01

2.4 血管环对硝普钠舒张反应性影响(见表4)模型组、氯沙坦钾组与正常组相比对硝普钠的舒张反应差异无统计学意义(P＞0.05),正常组、模型组及氯沙坦钾组的IC50及Emax相似,且无统计学意义(P＞0.05)。

表4 3组大鼠血管环对硝普钠舒张反应IC50及Emax(±s)

表4 3组大鼠血管环对硝普钠舒张反应IC50及Emax(±s)

组别 n IC50(×10-8mol/L)Emax(%)正常组 10 7.65±0.68 95.17±0.04模型组 10 4.52±0.50 95.45±0.03氯沙坦钾组 10 7.07±0.55 95.26±0.05

2.5 血清NO含量测定 模型组、氯沙坦钾组血清NO含量较正常组明显降低(P＜0.01),氯沙坦钾组较模型组NO含量明显升高(P＜0.01)。详见表5。

表5 3组血清NO含量(±s)

表5 3组血清NO含量(±s)

组别 n NO 含量(μ mo/L)正常组 10 60.97±0.53模型组 10 30.13±0.441)氯沙坦钾组 10 44.99±0.341)2)与正常组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.01

3 讨 论

由于DN的发病率逐年增加,因此对于DN的发病机制及治疗手段的研究成为目前研究的热点之一。DN是糖尿病最常见的微血管病变,最终导致毛细血管腔闭塞,肾小球硬化,是引起终末期肾衰竭的常见原因,糖尿病患者存在血管内皮功能损害,是发生慢性血管并发症的重要机制之一[6]。目前认为,内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化的早期改变,在糖尿病合并血管病变的发生中起重要作用[7]。AngⅡ是肾素-血管紧张素系统的一个效应物,是血管重塑因素中的重要介质[8]。也是一种强血管收缩物质,可以引起肾小球内囊压力的升高,导致肾小球高灌注、高滤过,诱导肾小球细胞凋亡、基质增生,导致肾小球萎缩、硬化,肾脏损害的早期则表现为微量白蛋白尿。由于循环及组织中AngⅡ的增加,刺激血管收缩,启动血管氧化应激反应,诱导血管内皮细胞凋亡和平滑肌细胞增生,导致血管内皮功能障碍。有研究证实,AngⅡ除了可以有收缩血管作用,还可以引起一系列的促炎症反应,促纤维化和对代谢的影响包括氧化应激、胰岛素抵抗和细胞外基质蛋白沉积。

近年的动物实验中离体血管环舒缩反应的测定,已经成为评价血管内皮功能的常用指标。血管内皮依赖性舒张功能的测定可作为反映血管内皮功能的重要指标,血管内皮依赖性舒张功能是指内皮细胞在药物(Ach)等作用下释放内皮源性舒张因子(NO等),从而导致内皮舒张,此作用依赖于内皮的完整性。DN由于长期糖、脂代谢紊乱,造成血管内皮细胞受损,功能紊乱[9],DN时血管舒张功能失调与血管内皮受损相关,血管内皮功能异常的特点是内皮依赖的舒张反应减弱,NO合酶表达减少,抑制NO活性,氯沙坦钾可能通过增加NO含量,从而改善血管内皮功能。本实验结果显示氯沙坦钾组大鼠NO含量明显高于模型组且低于正常组,说明氯沙坦钾可以增加DN大鼠NO含量,从而改善血管内皮依赖性舒张功能。

氯沙坦钾片属于ARB类药物,国内外多个临床试验已证实ARB类药物对肾脏及血管内皮功能的保护作用[10,11],由于循环及组织中AngⅡ的增加,刺激血管收缩,启动血管局部氧化应激反应,诱导血管内皮细胞凋亡和平滑肌细胞增生,导致血管内皮功能障碍。氯沙坦主要通过特异性的阻断 AngⅡ与其受体AT1的结合产生肾脏和血管内皮保护作用[12-14]。本实验中发现模型组较正常组出现多饮、多尿、多食的糖尿病表现,到后期出现尿蛋白增多等DN表现,用氯沙坦钾干预后发现氯沙坦钾组大鼠24 h尿蛋白定量与模型组大鼠相比较明显降低,说明氯沙坦钾具有减少白蛋白排泄的作用,对DN有肾脏保护作用。实验中发现氯沙坦钾组大鼠血糖较模型组有所下降,但是差异无统计学意义,说明氯沙坦钾药物干预后并不会明显改善DN的血糖水平。通过离体血管环反应性测定,氯沙坦钾组、模型组大鼠对NE的收缩反应和正常组相似,氯沙坦钾组大鼠对Ach舒张反应性明显高于模型组,但两组均低于正常组,而氯沙坦钾组对硝普钠的舒张反应性与模型组和正常组相似。这说明DN影响血管内皮依赖性舒张反应,而对血管内皮非依赖性舒张反应没有影响,ARB可能选择性的改善DN大鼠血管内皮依赖性舒张功能降低的作用。

总之,通过本实验的研究,氯沙坦钾可以减少尿白蛋白的排泄,保护肾功能,对DN血管内皮具有保护作用,因此早期应用氯沙坦钾即能显著改善DN患者的血管内皮依赖性舒张功能及增加NO的含量,为治疗DN提供参考。

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