淫羊藿苷对人外周血内皮祖细胞NO分泌的影响

申 静,马 华,武丽萍,宫建芳,杜海斌

心脑血管病是影响人们健康的重要疾病,动脉粥样硬化是导致心脑血管病的主要原因,而内皮细胞损伤是动脉粥样硬化的始动环节。1997年Asahara等[1]从外周血中分离出一类能分化成为内皮细胞,参与血管形成的单核细胞,并将之命名为内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)。EPCs不仅参与出生后血管形成,而且参与修复损伤血管内皮,在缺血性疾病中扮演着重要的角色[2,3]。随着对NO和心血管疾病之间关系研究的不断深入,使人们认识到NO在心血管疾病发生和发展中的中心地位[4],特别是血管内皮细胞产生的NO对维持心血管系统的正常生理功能具有积极的作用。本实验通过观察淫羊藿苷对人外周血内皮祖细胞体外分泌NO功能的调控作用,旨在探讨淫羊藿可能的内皮保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 外周血取自健康成年志愿者,约40 mL,淫羊藿苷购自中国生物制品(标准品),阿托伐他汀为北京嘉林药业股份有限公司产品。淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司,血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)为英国PeproTech公司产品,M199培养基、胎牛血清为美国Gibco公司产品,乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)和荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)购自美国Sigma公司,CD133和CD34分别为美国Ancell公司和美国BD公司产品,紫外可见分光光度计(UV-9100)为北京瑞利分析仪器公司产品,NO检测试剂盒购自南京建成生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 淫羊藿苷溶液的制备 用DMSO溶解淫羊藿甙粉剂,配置成1 μ g/mL原始液,室温条件下,充分震荡10 min,超声溶解1 min,以1 000 r/min,离心20 min后,除去沉淀物,保留上清备用。

1.2.2 细胞培养与鉴定 取健康成年志愿者新鲜外周血40 mL,以密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,接种于预先包被有人纤维连接蛋白的培养瓶中,加入含有胎牛血清的M199培养基(10%胎牛血清、VEGF 10 ng/mL,青霉素100 U/mL及链霉素100 U/mL),在37℃5%CO2孵箱中静置培养4 d。4 d后洗掉非贴壁细胞,换培养液继续培养至7 d。

培养7 d的细胞(以 0.25%胰酶消化,制成细胞悬液)分别与 Dil-acLDL(2.4 μ g/mL)和 FITC-UEA-I(10 μ g/mL)孵育 1 h,2%多聚甲醛固定,通过激光共聚焦显微镜鉴定,FITC-UEA-I和DiLDL双染色阳性细胞则培养细胞为正在分化的EPCs。另以成熟人内皮细胞作对照,采用流式细胞仪检测细胞表面标志CD34、CD133的表达。

1.2.3 实验分组 在培养的第7天,洗掉非贴壁细胞,收集贴壁细胞。之后以0.25%胰酶将各孔细胞消化下来制成细胞悬液,以为1×104/cm2的接种密度接种到96孔板,随机分为对照组(常规培养液)、阿托伐他汀干预组(终浓度10 μ mol/L)、不同浓度的淫羊藿甙干预组(淫羊藿甙浓度分别为10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL的条件培养液)。每组5个复孔。

1.2.4 细胞形态学观察 普通倒置显微镜下观察不同时期细胞的生长特点及形态。

1.2.5 EPCs NO含量的检测 将培养7 d的细胞接种于96孔板,24 h后分别给予阿托伐他汀及不同浓度淫羊藿苷干预24 h及48 h,每孔吸取上清 100 μL,按 NO试剂盒说明,取血清样本,配备所需试剂,按要求操作后在分光光度计550 nm波长处读取吸光度值,按公式计算血清NO浓度。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.5分析软件。计量资料用均数±标准差(±s)表示,采用重复测量设计资料方差分析及完全随机设计资料方差分析,组间资料比较采用ANOVA和 t检验。P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 EPCs的鉴定 培养7 d洗去不贴壁细胞及碎片后,可见典型细胞集落:中间为大量的圆形细胞,外周为纺锤形细胞。培养第10天荧光显微镜检显示:细胞摄取DiI-ac-LDL,显微镜下激发红色荧光,细胞与FITC标记荆豆凝集素I结合,显微镜下激发绿色荧光。双染色阳性细胞呈黄色,为正在分化的EPCs。流式细胞仪示贴壁细胞表达CD 34阳性(38.36±3.70)%,CD133阳性(13.91±1.47)%,进一步证实所培养细胞为EPCs。

2.2 细胞形态观察 倒置显微镜下动态观察可见:刚刚从外周血分离获得的单个核细胞呈圆形,体积小;在培养的第2天细胞开始出现成簇现象;第4天细胞开始由圆形转为梭形贴壁细胞;细胞培养第7天,多数细胞呈梭形或多角形,且有集落样结构出现。

2.3 淫羊藿苷和阿托伐他汀对EPCs的NO分泌的影响 随着淫羊藿苷浓度的升高,EPCs培养上清中NO的浓度相应升高,呈一定量效及时效关系。10 ng/mL淫羊藿苷组与对照组差异无统计学意义(P＞0.05),25 ng/mL、50 ng/mL淫羊藿苷组与对照组相比EPCs培养上清中NO浓度明显提高(P＜0.05或P＜0.01),表明药物具有提高培养液NO浓度的作用,并且随者药物浓度的增加效果逐渐增强。淫羊藿苷各浓度的作用效果均随着时间的延长而增强。阿托伐他汀组与对照组相比,EPCs培养上清中NO浓度显著提高(P＜0.01),但不同时间NO的含量差异无统计学意义(P＞0.05),提示阿托伐他汀组作用效果随着时间的延长没有增强趋势。不同浓度淫羊藿苷组与阿托伐他汀组同时间比较,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。可见,虽然中药淫羊藿与西药阿托伐他汀均可促进内皮组细胞分泌NO,但阿托伐他汀作用较为显著。详见表1。

表1 淫羊藿苷和阿托伐他汀对EPC的 NO分泌的影响(±s)

表1 淫羊藿苷和阿托伐他汀对EPC的 NO分泌的影响(±s)

组别 剂量 24 h 48 h淫羊藿苷组 10 ng/mL 66.599±4.495 111.695±17.857 25 ng/mL 92.491±12.5971)4)127.950±16.1921)3)50 ng/mL 134.576±10.2752)3)157.746±17.9682)3)对照组 50.068±5.085 60.339±5.130阿托伐他汀组 10 μ mol/L 165.017±14.4852) 169.525±5.9822)与对照组比较,1)P＜0.05,2)P＜0.01;与阿托伐他汀组同时间比较,3)P＜0.05,4)P＜0.01

3 讨 论

淫羊藿是中国传统的补益中药,始载于《神农本草经》,具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效。现代药理实验表明,淫羊藿有效成分为淫羊藿苷,其具有广泛的生理活性。据文献报道以淫羊藿苷为主要成分的制剂对心脑血管系统、骨代谢、免疫系统等方面具有广泛的药理功效[5]。中医理论中《素问◦逆调论》:“肾者水脏,主津液”,如果肾脏虚损、肾虚精亏一则水不涵木,肝失所养,疏泄失常,膏脂布化障碍;二则肾阳虚失于温煦,致脾阳不振,脾土运化失调,痰浊内生而发病[6]。肾功能异常,则津液代谢失常,膏脂不运阻于血管则会变生心血管疾病。研究已经表明内皮祖细胞在血管的损失及修复中起着至关重要的作用,他汀类药是广泛应用于临床的一种降脂药,最近的研究发现其还有很多有益的心血管保护作用,例如增加NO生物利用率、促进内皮祖细胞的动员、稳定动脉粥样斑块等[7]。

NO是体内重要的信使分子和效应分子。目前研究认为作为一种新型生物信息分子NO是一种能透过细胞膜扩散的自由基础。它与某些含氮衍生物一起通过和生物信息分子的相互作用参与机体保护、调节及逆转等机制,尤其参与调节心血管系统中众多的生理和病理生理过程。由内皮细胞所生成的NO具有多种生物学效应,NO几乎参与了人体各个平衡状态的维持,因此NO生物利用度的降低将直接导致内皮功能的损伤,这可以表现为[8-10]血管内皮依赖性舒张功能的减弱、血小板聚集的增加、白细胞与内皮细胞的黏附、血管平滑肌增生等,目前对于NO的研究中心已经从基础理论研究逐渐向应用方面过渡[11,12],主要开发NO供体型药物,己有一些研究成果问世。研究发现一些中药对促进血管内皮细胞NO合成和释放具有良好的效果[13]。

本实验研究证实随着淫羊藿苷浓度的提高,EPCs培养上清中NO的浓度相应升高,呈明显的量效关系;且48 h较24 h作用效果明显增强,呈明显的时效关系。提示淫羊藿苷可以提高人外周血内皮祖细胞NO的分泌,且呈一定的量效及时效关系,为淫羊藿的血管内皮保护作用、有效防治心脑血管疾病提供了科研依据。本研究表明,淫羊藿具有一定的促进人外周血内皮祖细胞NO分泌的内皮保护作用机制,但淫羊藿防治动脉粥样硬化,治疗心血管疾病的具体机制尚待进一步研究。

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