黄芩素对内毒素诱导的内皮细胞细胞间黏附分子-1表达的影响

李 岩,王宏敏,李 明,高智群,邝枣园

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是严重危害人类健康的疾病之一[1]。利用我国传统中医药资源开发抗AS药物,为AS的临床治疗开辟新途径具有重要的研究意义和实用价值。本课题组前期研究发现具有抗炎、抗感染作用的清热解毒代表方药黄连解毒汤具有抗 AS作用,但对于其作用机制尚不完全清楚[2]。

细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)主要存在于血管内皮细胞、单核细胞、淋巴细胞等表面,在正常情况下仅微弱表达。氧化型低密度脂蛋白、细菌及其脂多糖(LPS)和炎症因子等AS危险因素可诱导内皮细胞表达ICAM-1,介导单核细胞黏附于内皮细胞和游走至内皮下,分化为巨噬细胞,吞噬脂质成为泡沫细胞。因此,ICAM-1在AS的发生中具有重要作用[3]。本研究采用LPS刺激人内皮细胞株ECV-304为模型,观察黄连解毒汤中黄芩的主要活性成分之一黄芩素对ICAM-1表达的影响,从对黏附分子的影响角度初步探讨黄连解毒汤可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 黄芩素(上海中药标准化研究中心,含量98%);细菌内毒素(LPS,Sigma公司);Trizol(Invitrogen公司);两步法RT-PCR试剂盒、引物(Takara公司);ECL化学发光试剂盒(Pierce公司);抗抑制蛋白κ B(I-κ B)p65 和β-Actin 抗体(Santa Cruze公司)。PCR仪(Perkinelmer公司);紫外凝胶成像系统、蛋白电泳仪、电转仪、杂交箱和酶标仪(Bio-Rad公司)。

1.2 细胞培养及干预实验 人血管内皮细胞株ECV-304细胞为由本室保存。用DMEM培养基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μ g/mL链霉素)传代培养。取生长状态良好的ECV-304细胞接种到12孔培养板内,待细胞生长至80%融合状态后,用PBS清洗2次,更换培养液,按照分组分别加入PBS或不同浓度的黄芩素(终浓度分别为 1 μ mol/L、10 μ mol/L、5 0 μ mol/L)孵育1 h,然后加入LPS(终浓度1 μ g/mL)进行刺激。实验分组如下:正常对照组、黄芩素组、LPS组和黄芩素加LPS组。根据实验要求在相应时间点收集细胞进行后继实验。

1.3 RT-PCR检测ICAM-1 mRNA的表达 各组细胞加入相应刺激物后继续培养8 h,用Trizol法提取细胞总RNA,用紫外分光光度计测定A260/A280为1.8～2.0。以总RNA为模板,用Oligo-d(T)18为引物反转录合成第一链cDNA,特异性引物分别扩增ICAM-1和β-Actin。ICAM-1引物序列如下,Sense:5'-CCG AGC TCA AGT GTC TAA AG-3',Antisense:5'-TGC CAC CAA TAT GGG AAG GC-3',扩增长度369bp;β-Actin引物序列如下,Sense:5'-TGA ACC CT A AGG CCA ACC-3',Antisense:5'-CCA CAG GAT TCC ATA CCC-

3',扩增长度489bp。PCR条件为94℃预变性4 min,然后94℃变性45 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,共循环30次,最后72℃延伸5 min。1.5%琼脂糖电泳PCR产物,用Qautity One软件分析ICAM-1与β-Actin的PCR产物灰度值,以二者比值来表示ICAM-1 mRNA的相对表达量。

1.4 Western Blot 检测 ICAM-1和I-κ B的表达 ECV-304细胞加入刺激物后继续培24 h,提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。取50μ g样品煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳(5%的浓缩胶和 10%的分离胶),转膜,5%的脱脂奶粉 37℃封闭1 h,加抗ICAM-1、I-κ B或β-Actin单克隆抗体稀释液(1∶2 000),4℃孵育过夜,洗膜,加辣根过氧化物酶标记的相应二抗稀释液(1∶3 000)37℃孵育1 h,ECL法显影,Qautity One软件分析条带灰度值,以目的条带与β-Actin条带的灰度比值来表示蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 黄芩素对ICAM-1 mRNA和蛋白表达的影响 RT-PCR结果显示,在无外源性刺激的情况下内皮细胞ECV-304仅极低量表达ICAM-1,单独加入黄芩素对其表达无显著影响。LPS可以上调ECV-304细胞ICAM-1 mRNA的表达,而在LPS刺激前加入黄芩素进行预处理,可以显著抑制 LPS诱导的ICAM-1 mRNA增高。Western Blot结果同样显示,LPS上调ICAM-1蛋白表达,黄芩素预处理抑制ICAM-1蛋白表达上调。详见图1、表 1。

图1 黄芩素抑制LPS诱导的ECV-304细胞ICAM-1 mRNA和蛋白表达

表1 各组ICAM-1 mRNA和蛋白表达比较(±s)

表1 各组ICAM-1 mRNA和蛋白表达比较(±s)

组别 ICAM-1 mRNA/β-Actin ICAM-1蛋白/β-Actin正常对照组 0.127±0.047 0.177±0.042黄芩素组 0.145±0.047 0.260±0.089 LPS组 1.263±0.2121) 0.993±0.1051)LPS+1 μ mol/L黄芩素组 0.977±0.1122) 0.720±0.1152)LPS+10 μ mol/L黄芩素组 0.857±0.0652) 0.490±0.1442)LPS+50 μ mol/L黄芩素组 0.687±0.1063) 0.463±0.0832)与对照组比较,1)P＜0.01;与LPS组比较,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.2 I-κ B蛋白的检测 Western Blot结果显示,LPS诱导下ECV-304细胞 I-κ B被降解;LPS刺激前用黄芩素预处理可抑制I-κ B降解,上调胞浆内I-κ B含量,与 LPS组比较差异有统计学意义(P＜0.05),说明黄芩素能抑制 I-κ B降解,阻碍 LPS引起的巨噬细胞 NF-κ B信号途径活化。详见图2、表2。

图2 黄芩素抑制LPS诱导的内皮细胞I-κ B蛋白降解

表2 各组I-κ B蛋白表达比较(±s)

表2 各组I-κ B蛋白表达比较(±s)

组别 I-κ B 蛋白/β-Actin正常对照组 1.093±0.110黄芩素组 0.993±0.105 LPS组 0.373±0.0711)LPS+1 μ mol/L 黄芩素组 0.483±0.0952)LPS+10 μ mol/L黄芩素组 0.573±0.0952)LPS+50 μ mol/L黄芩素组 0.860±0.0892)与对照组比较,1)P＜0.01;与LPS组比较,2)P＜0.05

3 讨 论

AS是各种致病因子造成血管内皮损伤,导致单核细胞黏附和侵入血管内皮细胞,分泌多种炎症因子而引起的一种慢性炎症性反应[4]。其中,单核细胞与内皮细胞黏附,继而穿越内皮细胞层进入内皮下是AS形成的早期事件之一,其过程主要由细胞黏附分子参与[5]。血管内皮细胞表面的黏附分子ICAM-1可以和单核细胞、淋巴细胞膜上的相关受体结合,介导细胞间的黏附,并促使单核细胞迁移至内皮下分化为巨噬细胞,进一步吞噬脂质最终变为泡沫细胞[6];此外,ICAM-1还可以介导淋巴细胞在炎症局部的集聚,进一步促进AS的慢性炎症反应[3]。研究发现敲除ICAM-1基因可以减小动物AS斑块面积[7],因此,ICAM-1介导的炎症细胞与血管内皮细胞的黏附在 AS发生中具有重要作用。ICAM-1的诱导性表达与刺激物激活NF-κ B信号途径相关[8]。NF-κ B在无外界刺激情况下与抑制蛋白I-κ B结合,以无活性三聚体形式存在于细胞浆。外界刺激物激活 I-κ B激酶降解 I-κ B,使 NF-κ B活化进入细胞核,引起ICAM-1和其他炎症因子的表达。本研究结果证实血管内皮细胞在无刺激情况下极低量表达ICAM-1,LPS刺激可以导致血管内皮细胞 I-κ B降解,上调 ICAM-1基因转录和蛋白表达,与Chen等[9]研究结果一致。

黄连解毒汤为唐代王焘所著《外台秘要》中所收载的清热解毒的代表方剂,由黄连、黄柏、黄芩、栀子组成,功能清热燥湿、泻火解毒。本课题组前期研究发现黄连解毒汤能减轻兔AS斑块病变程度,缩小斑块面积[2],Sekiya也得到了类似的研究结果[10]。但由于黄连解毒汤成分复杂,难以对其机制详细研究,因此本实验采用黄芩的主要有效成分黄芩素,从单核细胞和内皮细胞黏附入手,观察黄芩素对黏附分子ICAM-1表达的影响,初步探讨黄连解毒汤抗AS的可能作用机制。实验结果显示,黄芩素在转录水平和蛋白表达水平都可以抑制LPS诱导的ICAM-1表达,其作用机制可能与抑制I-κ B降解,进而阻断NF-κ B通路活化有关。因此,推测抑制ICAM-1表达可能是黄连解毒汤抗 AS的作用机制之一。由于 NF-κ B通路同时介导了其他炎症因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)的表达,推测黄芩素也可以抑制这些炎症因子的表达,通过抗炎机制抑制AS斑块的形成。

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