细胞间直接接触诱导BMSC软骨分化的初步研究

刘 霞 周广东 刘 伟 曹谊林

细胞间直接接触诱导BMSC软骨分化的初步研究

刘 霞 周广东 刘 伟 曹谊林

目的探讨细胞间直接接触是否能够单独诱导骨髓基质干细胞（Bone Marrow Stromal Cells，BMSC）软骨分化。方法体外培养扩增猪BMSC与关节软骨细胞，将1.0×106的细胞总量以2 000 r/min离心8 min，制成细胞团块，即Pellet培养。实验分为5组，实验组：经0.5%多聚甲醛固定的软骨细胞与BMSC以1∶1混合；对照组1：同等数量的未经多聚甲醛固定的软骨细胞与BMSC 1∶1共培养制成Pellet；对照组2：同等数量的单纯软骨细胞制成Pellet；对照组3：同等数量的单纯BMSC制成Pellet；对照组4：同等数量的单纯经多聚甲醛固定的软骨细胞制成Pellet。每3天换液一次，每组3例。培养4周后，以大体观察、组织学、免疫组织化学、RT-PCR等方法对Pellet进行全面评价。结果培养4周后，实验组形成的Pellet，明显缩小，形状略不规则，颜色灰暗，柔软且没有弹性，组织学检测提示主要为纤维性成分及死细胞样结构，Safranin O染色及Ⅱ型胶原免疫组化均为阴性，RT-PCR检测未表达Ⅱ型胶原。对照组1和对照组2均形成圆盘状组织块，表面光滑，触之有一定弹性，组织学检测软骨陷窝形态规则，Safranin O染色及Ⅱ型胶原免疫组化均有阳性表达，RT-PCR检测Ⅱ型胶原高表达。对照组3的组织块明显收缩，呈褐色，无弹性。对照组4，细胞松散，不能形成Pellet。对照组3和4的各种软骨特异性相关检测均为阴性。结论细胞间直接接触不能够单独诱导BMSC向软骨分化，不是软骨细胞与BMSC混合共培养中发挥诱导作用的主要因素。

骨髓基质细胞软骨细胞细胞间直接接触多聚甲醛软骨形成

近年来，通过成体细胞与干细胞混合共培养诱导干细胞定向分化已成为干细胞的研究热点之一[1-3]。共培养方法不但是一种良好的诱导方法，而且深入研究共培养的诱导机制，可以为研究干细胞定向诱导分化和组织微环境提供有意义的参考。共培养诱导机制可能包括：①细胞分泌的多种可溶性因子通过旁分泌作用诱导干细胞分化；②细胞分泌的胞外基质形成特异的局部基质环境，包绕干细胞，诱导其分化；③细胞间直接物理接触，通过膜蛋白的直接接触，诱导干细胞分化。

我们在前期研究中，通过细胞标记已证实，软骨细胞与BMSC混合共培养能够诱导其向软骨分化[4]，并通过隔离共培养实验和软骨细胞条件培养液诱导实验,首先验证了软骨细胞分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSC向软骨细胞分化并形成软骨组织，是软骨细胞发挥诱导作用的主要因素之一。在这些实验中，虽然没有细胞间的直接接触，但仍然形成了软骨组织。本实验中，我们将软骨细胞经0.5%多聚甲醛固定后与BMSC混合离心形成Pellet，研究软骨细胞与BMSC单纯物理接触，能否诱导BMSC向软骨细胞分化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康长枫杂交猪6只（上海川沙养殖厂），雌雄不限，1～2月龄，体重6～8 kg。

1.2 猪BMSC的分离、培养与扩增

于股骨近端抽取骨髓5～10 mL，注入含肝素的离心管中。参照全骨髓培养法[5]，离心洗涤2次，加入含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM（GIBCO公司，美国）培养液制成细胞悬液，以7.5×105cells/cm2的密度接种于培养皿，于37℃、5%CO2、100%饱和湿度条件下培养。3～5 d后首次换液，待细胞生长近80%融合后，以0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，以1×104cells/cm2的密度接种，进行细胞传代，优选第2代细胞。

1.3 猪软骨细胞的分离、培养与扩增

取猪膝关节软骨，切成3 mm×3 mm×1 mm大小，以0.1%的Ⅱ型胶原酶消化8～12 h，过滤、离心、洗涤、计数。以含10%FBS的DMEM培养液重悬，按2.0×104cells/cm2的密度接种于培养皿，于37℃、5%CO2、100%饱和湿度条件下培养。48 h后首次换液，待细胞生长近融合后，以0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化，收集备用。

1.4 固定软骨细胞[2，6]

用PBS将4%多聚甲醛稀释成0.5%，0.22 μm滤器过滤后，备用。收集第1代软骨细胞，制成细胞悬液，2 000 r/min离心8 min，形成细胞团，弃去上清，加入无菌0.5%多聚甲醛20 mL，室温下固定2 h，2 000 r/min离心10 min，弃上清，加入PBS重悬，反复冲洗3次，制成细胞悬液备用。

1.5 软骨细胞与BMSCs共培养

实验分为5组。实验组：经多聚甲醛固定的软骨细胞与BMSC以1∶1混合，细胞总量为1.0×106个，2 000 r/min离心8 min制成细胞团块（即Pellet）培养；对照组1：同等数量的未经多聚甲醛固定的软骨细胞与BMSC共培养制成Pellet；对照组2：同等数量的未经多聚甲醛固定的软骨细胞制成Pellet；对照组3：同等数量的BMSC制成Pellet；对照组4：同等数量的单纯经多聚甲醛固定的软骨细胞制成Pellet。各组均每3天换液1次，每组3例，培养4周后检测。

1.6 检测

1.6.1 碘化丙啶（PI）染色检测多聚甲醛固定后的软骨细胞

培养关节软骨细胞爬片，取3张，经0.5%多聚甲醛固定后，PI染色1 min，蒸馏水冲洗，荧光显微镜下观察，未经固定的细胞爬片作为对照。

1.6.2 大体观察

观察各组Pellet培养过程中的变化，以及培养4周后取材时的大小、形状、质地、色泽的变化，并观察各组间的差别。

1.6.3 组织学检测

将取出的组织以4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片，HE染色，观察培养物的组织结构，包括组织的连续性、软骨陷窝形成情况；Safranin O染色，检测软骨特异性基质分泌情况；免疫组化检测各组标本Ⅱ型胶原的表达情况。

1.6.4 RT-PCR检测[7]

分别抽提上述各组组织的总mRNA，经RTPCR方法检测构建组织中Ⅱ型胶原的表达情况。

2 实验结果

2.1 软骨细胞经多聚甲醛固定后PI染色结果

PI不能透过完整的细胞膜，但能够透过死细胞的细胞膜而将细胞核染红。软骨细胞经多聚甲醛固定后，PI染色阳性，说明经固定后细胞已死亡，而未经固定的软骨细胞PI染色阴性（图1）。

2.2 大体观察

4周后取材，实验组形成的组织块明显缩小，形状略不规则，颜色灰暗，柔软没有弹性；对照组1和2均形成圆盘状组织块，表面光滑，触之有一定弹性；对照组3的组织块明显收缩，组织呈褐色，无弹性；对照组4，细胞松散，不能形成小组织块，因此无法取材作组织学检测（图2）。

2.3 HE染色

实验组的组织内主要为纤维性成分，还可见死细胞样结构；对照组1和2的组织内，特别是周边部位，有类似软骨样组织形成，软骨陷窝形态规则，呈圆形或椭圆形，陷窝内可见蓝染的胞核；实验组3主要为纤维性成分（图3）。

2.4 Safranin O染色

对照组1和2的组织内分布着大量红染的胞外基质，含有大量空泡样软骨陷窝，表明细胞分泌大量GAG成分；而实验组和对照组3染色为阴性（图4）。

2.5 Ⅱ型胶原免疫组化

与基质染色一致，对照组1和2的组织内有大量棕黄色颗粒沉积，说明组织内有大量Ⅱ型胶原表达，而实验组和对照组3为阴性（图5）。

2.6 RT-PCR

对照组1和2，均能表达成熟软骨的特异性基因Ⅱ型胶原，提示形成了成熟软骨样组织；实验组和对照组3，未见软骨特异性基因表达，表明在经过多聚甲醛固定的软骨细胞诱导下，或单纯BMSC不能自发形成软骨样组织；对照组4的β-actin几乎没有表达，说明在培养过程中其RNA已基本降解（图6）。

图4 Safranin O染色（100×）

图5 Ⅱ型胶原免疫组化染色（100×）

图6 RT-PCR检测Ⅱ型胶原基因的表达

3 讨论

细胞间直接接触，即细胞间接触性依赖的通讯，不需要分泌的化学信号分子的释放，代之以通过与质膜结合的信号分子与其相接触的靶细胞质膜上的受体分子相结合，影响其他细胞。这种通讯方式在胚胎发育过程中对组织内相邻细胞的分化具有重要作用[8]。这类信号分子与受体都是细胞的跨膜蛋白。每个细胞都有众多的分子分布于膜的外表面，或为蛋白质，或为糖蛋白。这些表面分子作为细胞的触角，可以与相邻细胞的膜表面分子特异性的相互识别和相互作用，以达到功能上的相互协调。

研究证实，在某些组织的共培养中，细胞间直接接触发挥了重要作用。例如，在体外通过心肌细胞与BMSC共培养的方法模拟心肌内环境，可以将BMSC诱导分化为心肌细胞，并证实直接的细胞与细胞间相互作用是BMSC分化为心肌细胞所必需的[1，9]。Ball等[10]通过基质干细胞与内皮细胞和成纤维细胞的共培养证实，与内皮细胞的直接接触是基质干细胞分化为血管内皮细胞的决定性因素。这些研究证明了膜相关信号介导的细胞间直接接触在细胞种系分化中的重要性。

我们将0.5%多聚甲醛固定后的软骨细胞与BMSC共培养，观察其软骨形成情况。多聚甲醛可以固定细胞成分，防止细胞融合的发生，而且不会破坏受体介导的细胞识别和相互连接，即某些细胞表面分子，如多种跨膜蛋白能够抵抗多聚甲醛的作用，固定后仍然能传递细胞间信号[2，11]。有研究发现，间充质干细胞与2%多聚甲醛固定的心肌细胞共培养后，可以表达心肌细胞特殊标志，如α-actin、desmin、myosin等，说明经多聚甲醛固定后，细胞膜蛋白仍能保持其活性[12]。因此，我们将多聚甲醛固定后的软骨细胞与BMSC共培养，软骨细胞已不能分泌可溶性因子和细胞外基质，但其细胞膜表面蛋白的作用仍然保留，这样可以单独研究细胞间直接物理接触在诱导BMSC向软骨细胞分化中的作用。

结果显示，经多聚甲醛处理后，软骨细胞PI染色阳性，说明细胞已被固定，与BMSC混合共培养，形成的Pellet结构较为松散，组织学和软骨特异性基质染色都没有软骨形成的迹象。单纯经多聚甲醛固定后的软骨细胞由于没有基质的分泌，也不能形成Pellet，更不能表达软骨特点。而对照组未经多聚甲醛处理的软骨细胞与BMSC混合共培养，形成了较成熟的软骨组织。这些结果提示我们，单纯的细胞间相互接触基本无软骨诱导作用，可能不是共培养中软骨细胞发挥软骨诱导作用的主要因素。

每种组织有其结构和功能的特殊性，不同组织需要的诱导环境是不一样的。因此，细胞间直接接触的诱导作用，对于不同组织也不能一概而论。例如，心肌组织作为功能性合胞体，心肌细胞的收缩是同步的，体现在结构特点上则为心肌细胞间有闰盘结构，该处细胞膜凹凸相嵌，并特殊分化形成桥粒，彼此紧密连接，有利于电信号、化学信号等的快速传导。而且，心肌细胞收缩时产生的机械牵拉也是诱导BMSC向心肌细胞分化的必要条件[9]。因此，心肌细胞与BMSC共培养，细胞间的直接接触不但涉及了细胞膜蛋白的作用，更重要的是心肌细胞收缩时对BMSC的机械牵拉作用也在发挥重要的诱导作用。软骨组织具有负重、润滑等功能，在正常软骨组织中，软骨细胞含量较少，主要是细胞外基质，软骨细胞被胞外基质包裹，互相之间并没有直接接触。研究证实，对于软骨细胞，细胞间的直接接触虽然对于胚胎时期的软骨分化有重要作用，但是软骨细胞间的直接接触也会导致软骨细胞肥大[13]。因此，对于软骨组织，细胞间直接接触所发挥的作用可能相对较弱。

本研究中，经多聚甲醛固定后的软骨细胞已经是死细胞，不能完全代表活体状态下的情况，而且多聚甲醛也有可能会破坏某些细胞表面结构而影响实验结果。因此，我们还需要对软骨细胞膜蛋白、细胞间连接等进行深入研究，以得到更为确切的结论。

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The Study on the Role of the Cell-cell Contact in Inducing Bone Marrow Stromal Cells Chondrogenesis

LIU Xia1, ZHOU Guangdong2,LIU Wei2,CAO Yilin1.
1 Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100144,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHOU Guangdong.

ObjectiveTo explore the possibility of cell-cell contact in initiating chondrogenic differentiation of BMSCs. MethodsPorcine BMSCs and chondrocytes were respectively in vitro expanded.And then chondrocytes were inactivated by 0.5%paraformaldehyde and co-cultured with BMSCs at a ratio of 1∶1.1.0×106mixed cells were centrifuged at 2 000 r/min for 8 min to form a cell pellet.The mixture of normal chondrocytes and BMSCs and the pure normal chondrocytes were respectively centrifuged likewise as positive controls(Ctrl 1 and Ctrl 2).The BMSCs and inactivated chondrocytes were respectively centrifuged likewise as negative controls(Ctrl 3 and Ctrl 4).All the pellets were cultured in regular media for 4 weeks and then evaluated for chondrogenic phenotype by staining with HE and Safranin O,and immunohistochemically with typeⅡcollagen.Expression of cartilage specific genes was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). There were 3 specimens in each group.Resultsthe specimens of BMSCs plus fixed chondrocytes failed to form cartilagelike tissue with negative expression of cartilage specific matrices at both gene and protein levels.The pellets in positive controls formed the mature lacuna structures and metachromatic matrices.CollagenⅡexpression could be observed by immunohistochemistry and RT-PCR examination.The specimens in negative controls formed fibrous tissues.Conclusion The cell-cell contact alone between chondrocytes and BMSCs was not enough to initiate chondrogenic differentiation of BMSCs.

Bone marrow stromal cells;Chondrocytes;Cell-cell contact;Paraformaldehyde;Chondrogenesis

Q813.1+2

A

1673－0364（2010）02－0070－05

2010年1月5日；

2010年3月17日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.02.003

国家重点基础研究发展规划项目（2005CB522702）；国家高技术发展计划项目（2006AA02A126）；国家自然科学基金项目（30801192，30973131，30772264）；上海市曙光计划项目（08SG19）；上海市科技启明星跟踪计划（09QH1401600）。

100144北京市中国医学科学院整形外科医院（刘霞，曹谊林）；200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科（周广东，刘伟，曹谊林）。

周广东。