大鼠LPS吸入性肺损伤模型制备的研究

严伟民 姜 虹 陈万涛

大鼠LPS吸入性肺损伤模型制备的研究

严伟民 姜 虹 陈万涛

目的建立一种误吸所致的肺损伤的动物模型，为进一步研究急性吸入性肺损伤的病理生理和临床治疗方法提供稳定的模型基础。方法48只成年雄性SD大鼠，随机分为生理盐水对照组（NS组）和实验组（LPS组），每组24只。利用喉镜暴露声门，实验组大鼠气管内滴注Lipopolysaccharide（LPS）1 mL/kg（0.5 mg/mL）制模，NS组大鼠气管内滴注1 mL/kg生理盐水。注药后1 h、6 h、12 h、24 h为观察时间点，每时间点各取材大鼠6只，行动脉血气分析、肺组织湿/干重比（W/D）分析，以及光镜观察肺组织病理改变。结果LPS组表现为持续性低氧血症，各时间点动脉血二氧化碳分压（PaCO2）下降，W/D比值和肺组织病理半定量评分升高，与NS组比较有显著性差异（P＜0.05）。光镜下LPS组见肺间质渗出、水肿、大量炎症细胞浸润及红细胞外渗等，达到ALI诊断标准。结论1 mL/kg的LPS作为致炎剂，采用喉镜暴露声门滴注可成功建立大鼠吸入性肺损伤模型，为进一步研究吸入性肺损伤的病变机制及治疗方法提供了理想的条件。

吸入性肺损伤炎症脂多糖模型

吸入性肺损伤是指气道内误吸入各种炎性刺激物，如强酸、胃返流物、异物等，引起的肺部临床病理综合征。全球因癌症、缺血性心脏病、脑血管疾病等原因[1-2]造成误吸、吸入性肺炎、急性肺损伤（Acute Lung Injury，ALI），乃至急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS）的病例近年呈上升趋势，使得呼吸系统疾病在所有死亡原因中占第3位，严重的ALI、ARDS的病死率达50%～60%。因此，如何防治误吸所致的吸入性肺损伤已成为临床上亟需解决的问题。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的脂多糖(LPS)成分,可作为抗原激活机体的免疫应答，激活白细胞，诱使TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的释放[3]，近年来成为研究急性肺损伤的理想致伤剂。以往的Lipopolysaccharide（LPS）致急性肺损伤动物模型大多是LPS静脉或腹腔注射导致的继发性肺损伤模型，这与气道直接吸入LPS所致的原发性肺损伤在早期肺病理表现、疾病进程,甚至临床治疗策略上都存在很大的差异[4-5]。本实验采用大鼠LPS气管内直接滴注的方法，模拟急性吸入性肺损伤的病理生理，以期改良模型制备方法，为进一步研究ALI的临床治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠48只（中国科学院上海实验动物中心），体重200～250 g，标准化饲养。

1.1.2 主要试剂和仪器

Lipopolysaccharide（LPS）（Sigma公司，美国）；大鼠专用喉镜（上海交通大学医学院附属医学院动物实验室提供）；光学显微镜（OLYMPUS，日本）；全自动血气分析仪（Raduometer，ABL 800 FLEX，美国）。切片机（LEICA公司，德国）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

48只健康雄性SD大鼠，按SPF级标准化饲养3天。将动物随机分为两组：生理盐水对照组（NS组）和实验组（LPS组）,每组24只。两组分别气管内滴入NS或LPS，滴注后1 h、6 h、12 h、24 h为观察时间点，各时间点每组取材6只。

1.2.2 大鼠LPS吸入致急性肺损伤模型的制备

所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，固定于操作台，使大鼠头高尾低位60°仰卧，予细绳圈套固定大鼠门牙，并用一棉签压住大鼠舌腹，上提张嘴，置入喉镜，依助辅助放大镜可见大鼠会厌及声门，在声门张大时，小心置入弯曲的7号钝头钢针，钢针顶端探至声门下约3 mm处，实验组缓慢滴注LPS 1 mL/kg(用0.9%NS配制LPS 0.5 mg/mL)，对照组气管内滴注1 mL/kg生理盐水。滴注完毕后立即退出钢针，将动物直立并左右翻转3次，使药物尽量均匀分布于两肺。

1.2.3 标本采集

取材前用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，肝素化注射器抽取大鼠腹主动脉血0.3 mL，测定动脉血气。

右支气管结扎后切取大鼠右肺上叶组织，0.9%生理盐水冲洗后称重备用。

于大鼠右心室置入18 G口径钝头钢针，并在左心耳剪一约2 mm的小切口，同时向右心室快速灌注生理盐水250 mL，冲洗肺血管床20 min，待外观洁白透亮后，用2%多聚甲醛继续灌注20 min，取右肺下叶组织4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、包埋。

1.2.4 观察指标

1.2.4.1 动脉血气分析

Raduometer ABL 800 FLEX型血气分析仪测定动脉血氧分压（Pressure of oxygen in arterial blood，PaO2）和二氧化碳分压（Pressure of carbon dioxide in arterial blood，PaCO2），并计算PaO2与吸入气中氧浓度分数（Fraction of Inspire O2，FiO2）的比值，即氧合指数（Value of oxygenation index）。

1.2.4.2 肺组织湿/干重比（W/D）测定

大鼠右肺上叶组织，以滤纸沾干表面水分，置于一干燥洁净的玻璃试管中，经电子天平精确称重后，置80℃恒温烤箱内烘干24 h后再称重，计算前后两者的比值，即为肺湿/干重比（W/D）。

1.2.4.3 肺组织病理形态学检查

光镜下观察肺组织病理学改变，按照Mikawa等[6]的方法进行肺组织病理半定量评分。评分标准：对肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润或聚集、肺泡壁增厚和(或)透明膜形成等4项指标，分别依病变轻重评为0～4分(0分指无病变或非常轻微病变；1分为轻度病变；2分为中度病变；3分为重度病变；4分为极重度病变)，总分16分。4项评定分数总和为肺损伤的总评分。

1.3 统计学分析

应用SPSS 16.0统计软件分析数据，数据以均数±标准差（x±s）表示。NS对照组与LPS实验组比较采用t检验，多个组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果

2.1 动脉血气分析

2.1.1 动脉血氧分压（PaO2）分析

NS组各时间点PaO2无明显差异（P＞0.05）。LPS组PaO2较NS组各时间点显著下降（P＜0.05），6 h时最低，PaO2值60.2±4.7 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），明显低于1 h时点（P＜0.05），此后逐步回升，24 h时的PaO2高于6 h、12 h时（P＜0.05）（表1）。

表1 NS组和LPS组大鼠动脉血氧分压(mmHg)的比较(x±s，n=6)

2.1.2 氧合指数（Value of oxygenation index）分析

各组大鼠实验过程中均自由呼吸，设空气中氧浓度为21%，氧合指数=动脉血氧分压/吸入氧浓度，计算得到各组氧合指数数值。

NS组各时间点氧合指数无明显差异（P＞0.05）。LPS组大鼠氧合指数较NS组各相应时间点显著下降（P＜0.05），其中6 h时降至最低，氧合指数为286.7±22.3，明显低于1 h时（P＜0.05），此后逐步回升，24 h时的氧合指数高于6 h和12 h时（P＜0.05）（表2）。

表2 NS组和LPS组大鼠氧合指数的比较(x±s，n=6)

2.1.3 动脉血二氧化碳分析

NS组各时间点PaCO2未见明显差异（P＞0.05）。LPS组1 h时PaCO2即降至最低（30.6±4.2 mmHg），此后逐步回升，24 h时的PaCO2高于其他时间点，但仍低于NS组（P＜0.05）（表3）。

表3 NS组和LPS组大鼠动脉血二氧化碳分压(mmHg)的比较(x±s，n=6)

2.2 W/D比值测定

NS组大鼠各时间点W/D比值没有显著性差异（P＞0.05）。LPS组大鼠W/D比值较NS组相应时间点显著升高（P＜0.05），其中6 h时升至最高，达6.33±0.69，此后逐步回落，LPS组各时间点比较无明显差异（P＞0.05）（表4）。

表4 NS组和LPS组大鼠肺组织湿/干重比（W/D）的比较(x±s，n=6)

2.3 肺组织病理形态学观察

2.3.1 光镜观察

光镜下，NS组大鼠肺泡结构清晰完整，肺泡隔均匀一致，壁薄光滑，肺泡腔中无渗出液或渗出的白细胞，肺间质少量炎细胞浸润。LPS组1 h时，大鼠肺泡腔及肺间质渗出、水肿、红细胞外渗，可见部分肺泡、间隔破坏及肺组织结构的毁损，中性粒细胞浸润；6 h时，肺组织结构毁损、肺间质大量中性粒细胞浸润及红细胞大量外渗，可见血管内皮细胞增生；12 h时，肺间质内大量淋巴细胞浸润；24 h时，红细胞外渗明显减少，肺间质内依然以较多淋巴细胞浸润为主（图1）。

图1 两组大鼠致炎后的肺组织病理形态(HE，400×)

2.3.2 肺组织病理半定量评分

比较显示，NS组各时间点肺组织病理半定量评分没有显著性差异（P＞0.05）。LPS组肺组织病理半定量评分较NS组相应时间点显著升高（P＜0.05），其中6 h时升至最高，达13.17±0.75，此后逐步回落，LPS组1 h时大鼠肺组织病理半定量评分低于6h、12 h、24 h时（P＜0.05）（表5）。

表5 NS组和LPS组大鼠病理半定量评分的比较(x±s，n=6)

3 讨论

急性吸入性肺损伤以肺毛细血管床损伤、低氧血症以及肺顺应性减低为特点，是由中性粒细胞、肺泡上皮细胞、单核巨噬细胞以及淋巴细胞等介导的肺过度炎症反应，是目前危重症医学领域的治疗难点之一。动物模型的建立对吸入性肺损伤的发病机制、病理生理改变、诊断和治疗等方面的研究具有重要意义。

尽管LPS致ALI/ARDS模型，如脓毒症肺损伤模型已相当成熟，但是通常都是采用静脉或腹腔注射途径制备的，所造成的动物肺损伤是全身炎症反应在肺部的表现，也称为继发性肺损伤[7-8]。与这种肺外因素导致的继发性肺损伤不同，我们所研究的吸入性肺损伤，是致病因子对肺组织的直接损伤，LPS直接作用于肺组织，破坏肺泡引起出血、肺水肿，使坏死组织、炎症细胞堆积，促使肺泡巨噬细胞和炎症反应链的激活，导致肺内炎症反应[9]，因而肺组织结构损伤更明显，属于原发性肺损伤。采用LPS气管内直接滴注的方式制备模型，符合临床上误吸等原因所致ALI/ARDS的病理生理。

目前，国内外对大鼠LPS气管内滴注法的报道不多，相关文献中介绍的LPS的配制浓度和致伤剂量差异较大。一般来说，在达到致伤“阈值”之后，LPS剂量越大，ALI程度就越重，并加速了ALI进展至ARDS，使实验大鼠的存活期缩短，导致实验观察窗变小。理想的动物模型应该能观察到疾病完整的病理生理，以及干预措施下疾病的转归，以达到为临床上设计防治措施的要求。因此，一个“合适”的致伤剂量是整个模型设计的关键。通过预实验我们发现，LPS气管内滴注法致大鼠急性肺损伤的致伤“阈值”大致为LPS 0.5mg/kg。利用1 mL/kg(浓度0.5 mg/mL)的LPS作为致伤剂，实验结果显示，实验组大鼠致伤后1 h，PaO2即降至70 mmHg，致伤后6～12 h持续在60 mmHg左右，直至24 h后，PaO2才有所回升，但仍明显低于对照组，符合ALI的持续性低氧血症表现。参照1992年欧美联席会议ALI和ARDS诊断标准[10]：ALI诊断标准为氧合指数≤300 mmHg，ARDS诊断标准为氧合指数≤200 mmHg，致伤后6 h、12 h时的氧合指数分别为286.7±22.3和297.2±17.3，达到了ALI的诊断标准，但未达到ARDS诊断标准，且在致伤12 h后氧合指数开始回升，至24 h时达到328.6±22.1，这符合我们建立一个肺损伤程度较轻、可提供较长观察周期的吸入性ALI的实验预期。我们还观察到，实验组大鼠致伤后呼吸频率加快，通气过度，因而PaCO2明显下降，这与人类ALI早期的临床表现相似。ALI早期最基本的病理生理改变就是肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞屏障对液体、蛋白通透性的增加，进而导致肺泡水肿。肺组织湿/干重比是反映肺组织水肿程度的良好指标。在我们的实验中，LPS组大鼠致伤后1 h,肺组织湿/干重比即明显上升，说明了LPS组大鼠致伤后早期即出现了肺泡毛细血管内皮细胞损伤，通透性增加，进一步表明我们的ALI模型是成功的。另外，我们配制的LPS也未引起大鼠即刻淹溺死亡。

光镜下观察肺组织病理形态，我们发现，LPS组大鼠肺组织出现肺间质渗出、水肿、红细胞渗出及大量炎症细胞在肺间质内积聚等表现，各时间点肺组织病理半定量评分变化与氧合指数的变化相一致，致伤后6～12 h评分最低。LPS致伤后1 h，以肺间质渗出、水肿和红细胞渗出为主，属于典型的ALI的早期病变；致伤后6 h，肺间质可见大量中性粒细胞浸润；致伤后12～24 h，红细胞外渗减少，肺间质内淋巴细胞浸润为主。淋巴细胞是晚期炎症细胞，结合同期PaO2、PaCO2、W/D比值的变化，我们推断此时大鼠肺部炎症开始得到控制。

在模型制备上，我们摒弃了以往常用的大鼠颈部气管切开或气管穿刺注射法。该方法虽然操作方便，成功率高，效果肯定，但本身是一种创伤性操作，颈部切口的大小、组织损伤的程度、手术时的无菌程度及术后感染，都会影响大鼠体内炎症细胞的释放和炎症因子的表达，增加了非实验因素对实验结果的影响。我们利用大鼠喉镜暴露声门，利用注射针通过声门滴注LPS的方法，效果肯定。最重要的是，此方法下，大鼠无额外的创伤，可以有效减少非实验因素导致的误差。此外，相比大鼠颈部气管切开穿刺法，我们的方法对大鼠气管的刺激更小，不易导致气管痉挛。本方法操作时应注意以下几点：①大鼠必须固定于倾斜的支架上，头高尾低，以保证LPS注入时不外流；②麻醉深度要合适，过浅的麻醉不利于暴露声门；③大鼠口腔空间狭小，可用一小号血管钳将鼠舌拉出口腔；④注射针需特制，弯曲的注射针能方便探到声门，而且针头必须磨钝，不然容易刺透气管壁而使LPS注射到气管外，我们采用的是弯曲的7号钝头钢针。

本研究选用1 mL/kg（浓度0.5 mg/mL）LPS作为致伤剂，利用喉镜暴露声门进行滴注，成功建立了大鼠吸入性肺损伤模型。本方法无额外创伤，损伤较轻，易于观察吸入性肺损伤病理生理发展，为进一步研究吸入性肺损伤的病变机制及干预治疗奠定了基础。

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Study on Lipopolysaccharide(LPS)-Induced Aspiration Lung injury in Rats

YAN Weimin1,JIANG Hong1,CHEN Wantao2.
1 Department of Anesthesiology;2 Department of Oral and Maxillofacial.Shanghai Ninth People′s Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:CHEN Wantao.

ObjectiveTo establish a rat model of aspiration lung injury(ALI)caused by airway lipopolysaccharide(LPS) inhalation,and to provide an experimental basis for its pathophysiological and clinical therapy.MethodsForty-eight adult male Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into 2 groups(n=24):negative control group(NC group)and experimental group(LPS group).The rats were made aspiration lung injury(ALI)model by intratracheal instillation of 1 mL/kg (0.5 mg/mL)LPS group and 0.9%NS(1 mL/kg)in NS group.The rats were randomly assigned to four subgroups(n=6)to be sacrificed at 1,6,12,and 24 hours after intratracheal injection.Other observation parameters included arterial blood gas,W/D ratio of lung tissue,and pathological changes of the lung under light microscopy.ResultsUnlike NS group,the rats in LPS group presented sustained hypoxemia,reduced pressure of carbon dioxide in arterial blood(PaCO2)at the four time-points, increase in W/D ratio and oxygenation index in all the subgroups(P＜0.05),and obvious interstitial changes suggested ALI such as exudation,edema,infiltration by lots of inflammatory cells,and leakage of red blood cells.ConclusionA rat model of ALI could be established by intratracheal instillation of LPS via laryngoscopy,which is very useful for further research on pathology and intervention therapy.

Aspiration lung injury;Inflammation;Lipopolysaccharides;Model

R971+.2

A

1673-0364（2010）02-0096-05

2009年11月30日；

2010年3月2日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.02.010

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院麻醉科（严伟民，姜虹）；口腔颌面外科（陈万涛）。

陈万涛。