血管瘤动物模型的研究进展

麦华明 郑家伟

血管瘤动物模型的研究进展

麦华明 郑家伟

血管瘤是婴幼儿最常见的良性肿瘤，典型特点是其生命周期分为3个阶段：增殖阶段发生在1岁左右，以内皮细胞增殖为特点，没有明确血管结构，管腔内红细胞不明显；消退期发生在1岁时，可持续到3～5岁，该阶段增殖减慢或停止，血管结构变得明显，管腔增大；消退完成期在5～8岁，这时血管被纤维脂肪残余和毛细管大小的管腔所替代[1]。通常情况下，血管瘤的预后良好，但部分儿童的肿瘤会影响组织和器官功能，甚至可危及生命。血管瘤的研究，从最早的使用鸡冠作为简单动物模型[2]到最新的血管瘤干细胞移植，随着现代分子生物学技术的快速发展，出现了使用各种技术建立的血管瘤动物模型。尽管目前还未能成功建立完全模拟血管瘤生物学行为特点的模型，但已有的进展为探索血管瘤的发病机制和临床靶向治疗奠定了基础。本文就血管瘤动物模型的研究进展进行综述。

1 多瘤病毒及基因转录

小鼠多瘤病毒（Murine polyomavirus，MPyV）是一种小DNA病毒，自1953年被发现以来，众多学者对其在肿瘤发生、发展中的作用进行了深入研究，发现它在体外能使细胞恶性转化，在小鼠的乳腺、唾液腺、骨、皮肤等器官组织能诱发多种肿瘤，如血管瘤、癌、肉瘤、淋巴瘤等。其基因的早期序列为重叠基因，编码3种蛋白质，即大T抗原（LT）、中T抗原（MT）和小T抗原（ST），它们具有相同的氨基端。MT被认为是病毒的主要癌基因，其编码的蛋白质是由421个氨基酸组成的膜结合蛋白，分子量为56 kD，通过疏水的羧基端将其锚着在细胞膜上，蛋白的大部分位于胞质内，并具有与磷酸激酶牢固偶联的特性，其中在Tyr-250、Tyr-315和Tyr-322处存在3个酪氨酸位点，可被特异性酪氨酸激酶系统磷酸化。目前认为，Tyr315本身的磷酸化是MT抗原引起细胞转化表型形成的关键过程，MT通过干预细胞信号转导机制影响细胞分裂。Bautch等[3]证实，多瘤病毒中的MT抗原基因对内皮细胞特别易感，将其整合到小鼠正常基因序列中，是小鼠罹患血管瘤的根本原因。Sandra等[4]用高浓度的PyV通过腹腔注射入大鼠体内，9 d后出现了大脑、皮肤、腹膜的血管瘤，肿瘤生长快速，伴发脑出血和贫血，导致大鼠在注射病毒后的3周内死亡。徐骎等[5-6]应用DNA显微注射法，将PyMT基因导入小鼠受精卵，并植入母鼠输卵管，从而将PyMT基因整合到小鼠DNA正常序列中，得到了主要分布于皮肤和黏膜表面的全身多发性血管瘤的小鼠动物模型，但产仔率低，存活时间不长（图1）。王延安等[7-8]通过PCR方法，从鸡的基因组序列中克隆绝缘子元件，构建四环素诱导调控的条件化转基因质粒，并将其调控元件和受控元件串联成一个载体，将MT基因亚克隆至此载体，行小鼠受精卵原核注射，获得转染MT基因阳性小鼠。强力霉素体外诱导部分阳性鼠MT基因表达，建立了可以传代的四环素诱导调控的MT转基因小鼠模型，但所形成的血管瘤样病变为囊性结构，组织学上更接近静脉畸形。

图1 应用DNA显微注射法，将PyMT基因导入小鼠受精卵，从而将PyMT基因整合到小鼠DNA正常序列中，得到了全身多发性血管瘤的小鼠动物模型

Williams等[9]用将携带PyMT的鼠内皮瘤细胞移植到成年小鼠体内，能诱导产生血管瘤，发现瘤体内的绝大多数内皮细胞来源于宿主。Dubois-Stringfellow等[10]将表达完整多瘤病毒早期编码区的基因转入小鼠，然后形成多发性血管内皮瘤，再将瘤体内的血管内皮细胞系提取，培养后注射入小鼠皮下或腹腔，均产生了血管肿瘤，组织学上符合血管内皮瘤或血管瘤，瘤体内有出血，还伴有血小板减少、贫血和脾肿大等卡-梅综合征症状。随着肿瘤的快速生长，卡－梅综合征加重，小鼠在3～5周内死亡，腹腔内注射的死亡时间更快，在注射1～2周后死亡。Bussolino等[11]将多瘤病毒中T抗原基因转化到小鼠，从形成的内皮瘤中培养出能够稳定致瘤的End内皮细胞系列；Vergani等[12]将其植入裸鼠，产生了血管瘤样病变，由于其成瘤率高，效果明显，该动物模型常被用作药物作用的研究[13-15]。Sausville等[16]使用重组RCAS/PyMT病毒感染SCL-TVA小鼠，将PyMT转化到小鼠体内的血管内皮祖细胞中，发现在小鼠腹膜后、肝、肠、卵巢、子宫等全身多发性血管瘤形成，但小鼠很快因内出血而死亡。据他们推测，可能是因为转入PyMT基因后，血管内皮祖细胞向血管瘤干细胞转化。

但不管使用何种转基因方式，PyMT诱导所形成的肿瘤组织学特征偏恶性，更接近于血管肉瘤或血管内皮瘤。

2 血管瘤组织移植法

Tang等[17]将人快速增殖期血管瘤的组织切片分成96份，按6份/鼠移植到裸鼠皮下，发现移植存活率为84.4%，在植入后2～4个月移植组织生长，然后逐渐消退。组织学检查发现，在植入后早期，细胞发生水肿、变性、坏死；大约30 d后，细胞密度升高，第45天时开始有丝分裂。在植入2个月后，移植组织主要由血管瘤组织组成并表现出消退的征象（图2）。随后，消退逐渐明显，移植组织逐渐被纤维脂肪组织替代，其主要的组成细胞是宿主的内皮细胞。但是，之前的研究结果却相反，血管瘤组织单独移植到裸鼠1个月后，所有移植瘤组织都不同程度地变小；90 d时，部分肿瘤完全吸收，其余均不同程度地变小、硬化、消退。镜下观察移植瘤组织，单纯肿瘤移植组均呈坏死、吸收，有大量吞噬细胞、纤维组织及少量小脓灶形成[18]。不同的结果可能与移植的血管瘤组织的不同增殖活性有关。他们还发现，在移植后每周肌注大剂量雌激素1次，1个月内的移植血管瘤组织体积无明显改变，1～3个月后体积增大，组织学表现符合毛细血管瘤特征[18－19]。该模型的建立，明确了雌激素对血管瘤的促进作用，成功保持了血管瘤的生物学特征，但尚不能进一步地阐明血管瘤的发生机制。

图2 将快速增殖期的人血管瘤组织切片移植到裸鼠皮下建立血管瘤动物模型

3 血管生长因子转基因技术的应用

许多研究发现，在血管瘤组织中，内皮细胞生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等血管生长因子高表达；在动物实验中，应用VEGF基因表达治疗缺血性疾病如心肌梗塞时，血管生长因子的过量表达会在局部产生小的血管瘤样病变[20]。

Gualandris等[21]以反转录病毒载体，将人bFGF的cDNA转染入小鼠主动脉内皮细胞系，将细胞注射入裸鼠后，产生了类似卡波西肉瘤样的血管化病灶；注射到无血管的兔角膜，可诱导血管生长；注射入鸡囊胚，则在绒毛尿膜囊形成血管瘤样病变。

Kitajima等[22]通过转基因技术，在兔肝局部以高表达的VEGF来研究VEGF165与动脉硬化症的关系，却发现转基因兔肝血窦增大，形成大小不同的血管网，具有弥漫性血管瘤的特征，同时发生溶血性贫血、血小板减少症和脾肿大等卡－梅综合征类似症状（图3）。许振起等[23]向裸鼠皮下移植重组腺相关病毒包装的人血管内皮细胞生长因子（hVEGF121）质粒，观察到注射部位肿块的隆起和变小等与血管瘤相似的变化，成瘤率为100%。组织学检查发现，基因移植处的组织内大量新生内皮细胞排列成紊乱的管腔状结构。

图3 将显微注射VEGF165cDNA进入兔受精卵，获得在肝细胞特异性表达hVEGF的转基因兔

4 血管瘤干细胞移植技术的应用

Boye等[24]发现，血管瘤内皮细胞是无性繁殖的，并表现出增高的生长和迁移特性。Walter等[25]分析增殖期血管瘤组织切片，发现了细胞的克隆性质。大量研究发现，血管瘤内皮细胞可能来源于同一个原始干细胞。2008年，Khan等[26]首次报道从婴幼儿血管瘤组织中提取出血管瘤干细胞（HemSCs），这种干细胞具有旺盛的增殖活性，将单个细胞克隆后，植入裸鼠体内，7 d后可形成人类血管，从血管组织提取出干细胞，植入第2只裸鼠后，能再次形成血管组织。这种形成的血管组织能够表达婴幼儿血管瘤的免疫诊断标志物GLUT-1和Merosin；植入2个月后，血管数目减少，而脂肪细胞变得明显（图4），证实血管瘤来源细胞在裸鼠体内形成了血管和脂肪细胞。该研究重建了独特的婴幼儿血管瘤演变过程：形成血管，随后转变为脂肪组织，提示干细胞可能是婴幼儿血管瘤的来源细胞。但所形成的血管瘤组织并没有出现与临床类似的快速增长，可能与遗漏了关键的细胞成分有关。血管瘤组织中是否存在干细胞，其作用机制和调控机制等，均有待深入研究。

图4 采用血管瘤干细胞建立裸鼠模型

5 其他技术

Spitsbergen等[15]将致癌物N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍与斑马鱼胚胎或鱼苗接触，诱导了血管瘤、血管肉瘤等一系列间质细胞肿瘤的发生，但多数为恶性肿瘤。

Dyck等[28]通过aP2-Cre转基因技术调控多形性腺瘤基因1（PLAG1）在小鼠的表达，发现在腺体、生殖腺、肩胛区等富有脂肪组织的部位PLAG1过表达，导致海绵状血管瘤样病变的产生。他们推测，这可能与PLAG1诱导了胰岛素样生长因子的信号有关。但存在血管管腔粗大、内皮细胞扁平等情况，不符合增殖期血管瘤的特征。

Tan等[29]将人血管瘤组织切片包埋在纤维蛋白凝胶，置于培养板内培养，并加入少量无血清缓冲盐培养液，观察到血管瘤组织边缘长出了微细的血管，不同阶段的血管瘤组织出现血管的时间不同：增殖期最早，在1～4 d就可观察到，消退期5～7 d，消退完成期7～12 d。该实验还证实了培养的血管瘤组织保留了在体内时的一些生物学特性（如内皮细胞、肥大细胞的表型和数目，基底膜的组成，生长因子的表达等）。江成鸿等[30]则改进了这种方法，降低了凝胶中纤维蛋白原的浓度，并加入10%胎牛血清，同样观察到了组织块边缘生长出“枝芽状”细小血管。这种模型对研究血管瘤的细胞、生化和分子机制以及药物的作用机制有一定价值，但最长只能持续数周时间，且需要手术标本的支持。

6 展望

建立一个理想的血管瘤动物模型，对于研究血管瘤的发病机制和药物作用机制，从而提高临床疗效，发现新的治疗方法或途径具有重要作用。然而，目前报道的大多数血管瘤动物模型都不能模拟血管瘤生长、消退的自然过程，而且不能表现出类似的组织病理特点。由于人类血管瘤并不发生在其他物种，进一步增加了建立动物模型的难度。随着组织工程技术的发展，提取出血管瘤干细胞并移植在裸鼠体内，成功再现血管瘤的一些特征，有望成为现实。

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R732.2

B

1673－0364（2010）02－0114－04

2009年12月18日；

2010年2月26日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.02.016

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔颌面外科。

郑家伟。