高效液相色谱法测定华蟾素片中华蟾素毒基和脂蟾毒配基含量

王卫锋 ，罗红锁，李 捷

（1.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003； 2.陕西省长武县中医医院，陕西 咸阳 713600；3.陕西中医学院2007级研究生，陕西 咸阳 712083）

华蟾素片系由干蟾皮制成的肠溶片，具有解毒、消肿、止痛功效，用于治疗中、晚期肿瘤、慢性乙型病毒性肝炎等症。其药品标准中无含量测定方法[1]，不利于制剂的质量控制。笔者采用高效液相色谱（HPLC）法测定了华蟾素片中华蟾素毒基和脂蟾毒配基的含量，旨在为进一步完善产品质量标准提供参考。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（SSI）；N-2000色谱工作站（浙江大学）。华蟾酥毒基对照品（批号为110803-200504），脂蟾毒配基（批号为110718-200507），供含量测定用，均购自中国药品生物制品检定所；样品（自制，批号为 2001101，20071102，20071103）；乙腈（HPLC级试剂，美国TEDIA公司）；超纯水，其他试剂（分析纯）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Thermo Hypersil-Keystone ODS Hypersil柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.5%磷酸二氢钾溶液（用磷酸调 pH 至3.2）- 乙腈（55 ∶45）；检测波长：296 nm；进样量：10 μL。理论塔板数按华蟾酥毒基和脂蟾毒配基计算应分别不低于4 000。此条件下的对照品、供试品、阴性对照品溶液色谱图见图1。供试品溶液色谱中，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基色谱峰与其他组分达到基线分离，阴性样品不干扰样品测定。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的华蟾酥毒基对照品、脂蟾毒配基对照品适量，分别加甲醇使溶解，制成每1 mL含0.06 mg华蟾酥毒基和每1 mL含0.01 mg脂蟾毒配基的溶液，作为对照品溶液。取样品20片，精密称定，研细，取约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇20 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液即得供试品溶液。按处方配制不含干蟾皮的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制得阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：分别取对照品溶液（华蟾酥毒基质量浓度为0.1009mg/mL；脂蟾毒配基质量浓度为 0.02448mg/mL）3，4，6，8mL，置10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。取上述4种混合对照品溶液及原溶液按拟定的方法进样，记录色谱图，测定峰面积。以峰面积对进样量进行回归，得标准曲线方程。华蟾酥毒基线性方程为 Y=727 788 X+7 360，r=0.999 8（n=5）；脂蟾毒配基线性方程为 Y=734 578 X+1 377，r=0.999 8（n=5）。结果表明，华蟾酥毒基进样量在0.302 7～1.009 μg范围内、脂蟾毒配基进样量在0.073 44～0.244 8 μg范围内与峰面积值线性关系良好。

精密度试验：取同一对照品溶液，重复进样5次，依法测定。结果峰面积的 RSD华蟾酥毒基为1.71%，脂蟾毒配基为1.50%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于 0，2，4，6，8 h时进样测定。结果峰面积的 RSD华蟾酥毒基为2.26%（n=5），脂蟾毒配基为2.63%（n=5），表明供试品溶液在8 h内稳定。

重现性试验：取同一批（批号为20071101）样品，依法制备供试品溶液并测定华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量。结果平均总含量为0.156 mg/片，RSD为1.36%（n=5），表明方法重现性良好。

加样回收试验：取华蟾酥毒基对照品溶液（0.201 8 mg/mL）2，2，3，3，4，4 mL，分别置具塞锥形瓶中，再依次加入脂蟾毒配基对照品溶液（0.049 88 mg/mL）2，2，3，3，4，4 mL，挥干溶剂，分别加入已知含量的华蟾素片（批号为20071101）约1.5 g，按供试品溶液制备方法制备溶液并进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法分别测定。结果批号为20071101，20071102，20071103样品中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总含量分别为0.156，0.135，0.127 mg/片（n=3）。

3 讨论

试验过程中比较了几种色谱柱（Luna C18柱、Diamonsil C18柱、Hypersil ODS柱），结果以Hypersil ODS色谱柱分离效果最好；比较了0.5%磷酸二氢钾溶液-乙腈（50∶50）和0.5%磷酸二氢钾溶液-乙腈（55∶45）两种流动相（均用磷酸调pH至3.2），结果后者的分离效果好；也考察了 3 种流速（1.0，0.8，0.6 mL/min），0.8 mL/min时分析时间较短，分离效果好。

在选定的色谱条件下，华蟾酥毒基（保留时间12.208 min）与相邻峰的分离度分别为5.513和2.096，脂蟾毒配基（保留时间13.773 min）与相邻峰的分离度分别为2.096和1.819；理论塔板数以华蟾酥毒基计为6 613，以脂蟾毒配基计为6 739。采用HPLC法测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量，样品处理方法简单，结果准确，有效成分分离较好，故该法可作为华蟾素片的质量控制方法。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂（第14册）[M].北京:化学工业出版社，1997:31.