四种嵌合免疫受体在 T淋巴细胞中的表达分析

骆耐香 陈森洲 徐雅娟

(桂林医学院,广西 桂林 541004)

大多数肿瘤相关抗原(TAA)是自身抗原,由于胸腺的选择机制和耐受机制,机体针对这些抗原产生的 T淋巴细胞中大多数T细胞受体(TCR)的亲和力都比较低,从而限制了其肿瘤识别及杀伤效果。将克隆的高亲和力识别 TAA的T淋巴细胞受体也称嵌合免疫受体(CIR)通过基因转染技术转染给 T淋巴细胞,可以使重定向的原来无肿瘤识别能力的 T细胞在体外和体内有效识别并杀伤肿瘤细胞〔1〕。近年来利用基因工程技术构建的 T淋巴细胞嵌合免疫受体,它包括识别TAA的单链抗体(scFv)和T淋巴细胞的活化基序,通过真核细胞表达载体转染T淋巴细胞,使 T淋巴细胞能识别并杀伤肿瘤细胞。我们将含人源化抗癌胚抗原(CEA)scFv的 4种 CIR,即 CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3,转染人T淋巴细胞后检测其在人 T淋巴细胞的表达,筛选出高表达的CIR,为进一步进行体内实验提供基础,同时为这一治疗策略最终应用于临床提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和材料 电穿孔仪NucleofectorTM为Amaxa Biosystems公司产品,流式细胞仪 FACS Calibur为美国 BD Biosciences公司产品。培养基AIM-V购自Sigma公司。健康人外周血由福冈红十字血液中心提供。CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3为本研究室制备,见图 1。别藻兰蛋白(APC)标记试剂盒购自日本Dojindo分子技术有限公司,按说明将其标记 CEA。

图1 四种 CIR基因(CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3)简图

1.2 细胞分离与培养 按常规方法分离淋巴细胞。将分离的人 T淋巴细胞在含 10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的 AIM-V培养基中,37℃含 5%CO2的细胞培养箱中培养,每 2天换液 1次,取对数生长期细胞备用。

1.3 基因转染 将 4种CIR通过电穿孔的方式转染人T淋巴细胞。按照产品说明,用 100μl电穿孔液 Nucleofector·Solution重悬 T细胞 2×106后,加入 4μg CIR,使用程序 A-23进行电穿孔转染后即移入预先预热的 AIM-V培养液中,置 37℃含 5%CO2的细胞培养箱内培养。

1.4 流式细胞术 首先在转染后 16 h收获并调整细胞浓度为 1×106/ml于 Eppendorf管中 ,分别加入 400μg/L CEA-APC与 FACS-PBS混合液 200μl,混匀于冰上 1 h,每隔 15 min颠倒混匀,PBS洗 2次后,悬浮于 500μl FACS Flow溶液中,采用流式细胞仪 FACSCalibur检测分析不同的 CIR在 T细胞表面与CEA定向结合情况。以不含基因的空载体经电穿孔后作为阴性对照。

2 结 果

CIR1、CIR2、CIR3可有效表达在 T细胞表面,与 CEA-APC发生定向结合,曲线高出阴性对照并向右移,其中 CIR3效果更好,而 CIRZ未与 CEA-APC结合,见图 2。

图2 4种CIR在人T淋巴细胞表面表达的流式细胞术分析

3 讨 论

肿瘤过继免疫治疗虽然成功地应用于黑色素瘤和肾细胞癌的治疗,但对结肠癌、乳腺癌等实体肿瘤的治疗效果并不满意,其主要原因可能是培养足够的肿瘤特异性淋巴细胞非常困难。随着分子生物学技术及基因工程技术的迅猛发展,构建T淋巴细胞的 CIR成为可能,CIR包含识别 TAA的单链抗体和T淋巴细胞活化的协同刺激分子 CD28、CD3ζ链等,通过体外转染到 T淋巴细胞的表面,以发挥抗肿瘤功能。

CEA是目前研究最广而且最具有潜力的靶抗原之一。它是一类主要的TAA,为分子量为 180 000的糖蛋白,最先是在结肠癌提取物中发现的抗原。现已知 CEA不但广泛存在于各种人类肿瘤细胞中,也存在于正常胃肠组织和胎儿小肠上皮细胞中,但正常组织中的CEA不直接分泌到血液和组织液中。因此,CEA可作为肿瘤免疫治疗非常有用的一个靶分子〔2,3〕。机体有效抗肿瘤免疫需要免疫系统能够识别肿瘤抗原,并最终利用免疫效应机制清除肿瘤细胞。大量的体外实验及动物实验证明,用抗TAA的TCR重定向的T细胞具有特异性的肿瘤杀伤功能〔4,5〕。由于人源抗体比鼠源抗体在肿瘤的免疫治疗和基因治疗中有更大的潜力,我们构建了 4种含人源抗CEA单链抗体的 CIR,分别为 CIRZ、CIR1、CIR2和 CIR3,而 CEA特异性CIR可以表达在 T淋巴细胞表面〔6〕。本实验发现有 3种 CIR(CIR1、CIR2、CIR3)可以在 T淋巴细胞表面表达,其中 CIR3表达最好。与 CIRZ不同的是,3种可在T淋巴细胞表面表达的CIR具有的共同之处是胞外段均有铰链区,推测这类CIR容易在细胞表面表达,继而可与 CEA发生结合。目前报道的所有临床应用的 CIR的信号传导均使用 CD3ζ链,而近来的研究发现,只用 CD3ζ链作为信号传导会导致活化的淋巴细胞凋亡,而在单链抗体与 CD3ζ之间加入共刺激分子(如 CD28)能有效地增强活化淋巴细胞的功能并防止细胞凋亡。我们利用人源化抗CEA的单链抗体的靶向性和CD3ζ胞内区、跨膜区的共刺激信号,构建真核表达载体,转染 T细胞,旨在制备能活化的有CEA靶向性的外周血 T细胞来杀伤肿瘤细胞。该实验结合了杀伤性 T细胞的抗肿瘤作用与协同刺激分子两大研究热点,使体液免疫与细胞免疫有机结合,利用了TCR/CD3ζ中抗原识别和信号传导的独立性,将抗体分子的导向作用和T细胞活化所需的双信号相结合,构建scFv-CD3ζ肿瘤特异性T细胞能降低T细胞活化的阈值。而且构建的肿瘤特异性 T细胞的杀伤功能由于不受 MHC限制有一定的临床应用价值,可以提高抗肿瘤综合免疫治疗水平。

临床研究表明,过继性输注肿瘤特异性 T淋巴细胞可通过抑制肿瘤细胞的生长而有效的治疗肿瘤。临床应用的肿瘤特异性T淋巴细胞可从肿瘤病人的外周血、淋巴结或者肿瘤组织中分离。美国国立癌症研究所进行的一期临床试验中,对 17例转移性黑色素瘤病人用Mart1TCR基因修饰的自体外周血T淋巴细胞进行治疗,两例病人出现客观疗效,这是首次基因治疗有效用于肿瘤免疫治疗的报道。在该两例病人中持续检测到高达 40%～70%的外周血细胞中含有基因标记,并且长达一年之久〔7〕。随着更多更好的 CIR的构建及治疗方案的改善,有望在用基因修饰的 T淋巴细胞治疗肿瘤方面取得突破进展。

1 Gross S,Walden P.Immunosuppressivc mechanisms in human tumors:why westill cannot curecancer〔J〕.Immunol Lett,2008;116(1):7-14.

2 Pavoni E,Flego M,Dupuis ML,et al.Selection,affinity maturation,and characterization of a human scFv antibody against CEA protein〔J〕.BMC Cancer,2006;6(1):41.

3 Aldrich WA,Ren C,White AF,et al.Enhanced transduction of mouse bone marrow-derived dendritic cells by repetitive infection with self-complementary adeno-associated virus 6 combined with immunostimulatory ligands〔J〕.Gene Ther,2006;13(1):29-39.

4 Zhao Y,Zheng Z,Robbins PF,et al.Primary human lymphocytes transduced with NY-ESO-1 antigen-specific TCR genes recognize and kill diverse human tumor cell lines〔J〕.J Immunol,2005;174(7):4415-23.

5 Rosenberg SA,Dudley ME.Adoptive cell therapy for the treatment of patients with metastatic melanoma〔J〕.Curr Op in Immunol,2009;21(2):233-40.

6 Shibaguchi H,Luo NX,Kuroki M,et al.A fully human chimeric immune receptor for retargeting T-cell to CEA-expressing tumor cells〔J〕.Anticancer Research,2006;26(6):4067-72.

7 Morgan RA,Dudley ME,Wunderlich JR,et al.Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes〔J〕.Science,2006;314(5796):126-9.