脑梗死患者过氧化物酶体增生激活型受体 γmRNA表达变化及其与C-反应蛋白的相关性

卢 冬 陆小婵 覃志坚 韦世革

(右江民族医学院附属医院检验科,广西 百色 533000)

过氧化物酶体增生激活型受体 γ(PPARγ)可在体内多种组织中表达,参与体内多种生理和病理生理过程。体外细胞培养研究表明,PPARγ的激活可以抑制周围血淋巴细胞对炎性血细胞因子的分泌。研究发现 PPARγ的特异性配体可以通过调节炎性反应而减轻实验性心肌缺血组织的病理损伤〔1〕。本研究旨在观察脑梗死患者周围血淋巴细胞中 PPARγmRNA的表达变化及其与血清 C反应蛋白(CRP)水平的相关性,探讨PPARγ在脑缺血炎性病理损伤中的可能作用机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2005年 1月至 2008年 7月在我院神经内科就诊的发病 3 d以内的脑梗死患者。所有患者均符合 1995年全国第四届脑血管病学术会议制定的诊断标准〔2〕。并且经 CT证实,共收集符合入选条件患者 64例,排除有心肌梗死、周围血管栓塞疾病、肿瘤患者,以及发病前 2 w有炎性病变史或入院时发生感染性疾病者(如严重的上呼吸道感染、肺炎、高热等)、有严重的肝肾功能不全患者等。正常对照组来自同期健康体检者,除具备以上排除标准外还均需询问并证实无心脑血管病史,共 60例。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取 抽清晨空腹肘静脉肝素抗凝血 6 ml,淋巴细胞分离液提取单个核细胞后,采用吸附柱过滤法分离淋巴细胞,经磷酸盐缓冲液(PBS)液洗涤后加 1 ml Trizol,震匀,室温静置 8 min,后经氯仿分层,异丙醇沉淀和 75%的焦碳酸二乙酯(DEPC)酒精洗涤干燥后,将所得 RNA溶液溶于 0.1%DEPC水溶液中,4℃ 12 000r/min离心 15min,吸取上清液到新的 1.5 ml菌种保存管(EP管)中,加等体积异丙醇,4℃12 000 r/min离心 10 min,弃上清,加 DEPC及新配制的 75%乙醇1 ml洗涤总 RNA,4℃ 7 500r/min离心 5min,弃去上清液,瞬时离心后用小吸管吸尽残留液体,置冰浴盒内,自然晾干。

1.2.2 cDNA的合成 取 RNA 2μg,加 Olig(dT)18μl,于 60℃水浴 10 min,再放冰上骤冷,而后加 RNA酶抑制剂、M-MulL V逆转录酶等,60℃孵育 60 min,95℃灭活酶 5 min,最后将将逆转录产物用于 PCR扩增。

1.2.3 PCR扩增 取上述合成的 cDNA 2μl加入 2.5 U的Taq DNA多聚酶、10×PCR缓冲液、10 mmol dNTP混合物、25 mmol MgCl2及目的引物和内对照,PPARγ的引物序列为 5′-CTTCACTGATACACTGTCTGC-3′,长 度 为 207 bp,内 参 物 为(GAPD),长度为 306bp。引物均由上海生物工程服务有限公司合成。于 PCR仪内扩增 31个循环,反应终末 72℃延伸10 min,最后 PCR产物于含有溴化乙锭(EB)的 1.5%琼脂糖凝胶中电泳。

1.2.4 血清CRP测定 抽空腹静脉血 2 ml(与提 RNA的血液同时抽取),离心取血清,7060全自动生化分析仪用免疫透射比浊法测定 CRP含量。

1.3 统计学处理 所有数据输入 SPSS10.0数据包进行统计分析,构成比 χ2检验,独立样本间的比较采用 t检验。

2 结 果

2.1 两组一般情况资料对比 脑梗死组除了收缩压和白细胞数较对照组明显升高外(P＜0.01),其余两组在年龄、吸烟、体重指数各项指标两组间无显著意义(P＞0.05)。见表 1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组 PPARγmRNA、血清CRP水平比较 将 PCR电泳凝胶图像分析系统测量,计算PPARγmRNA的相对比值。脑梗死组 PPARγmRNA表达明显低于正常对照组(P＜0.01),脑梗死组 CRP水平明显高于正常对照组(P＜0.01)。见表 2。

表2 两组 PPARγmRNA及 CRP表达比较(x±s)

2.3 脑梗死患者PPARγmRNA和血清CRP的相关性分析将周围血淋巴细胞 PPARγmRNA表达和血清 CRP水平进行相关性分析,PPARγmRNA表达越低,CRP水平越高,二者呈负相关(r=-0.539,P＜0.01)。

3 讨 论

PPARγ作为一种细胞核受体,通过位于靶基因启动子中的过氧化小体增殖物反应元件(PPRE)结合后调控靶基因的转录。CRP作为循环中的急性反应时相炎症蛋白,在各种急性炎症、组织损伤、心肌梗死、手术创伤等疾病发作后数小时迅速升高,并有成倍增长之势。病变好转时,又迅速降至正常,其升高幅度与感染的程度呈正相关。在患者疾病发作时,CRP可早于WBC而上升,恢复正常也很快,故具有极高的敏感性。

本研究发现,脑梗死患者发病早期 PPARγmRNA表达明显下调,同时 WBC及 CRP较较正常对照组显著增高,且PPARγmRNA表达与CRP含量呈负相关。提示PPARγ可能参与了脑缺血的病理过程,通过调节 CRP路径参与脑梗死病理方面的炎症反应,引起的组织损伤和促进血栓形成。

PPARγ激活后可经抑制包括淋巴细胞和单核巨噬细胞在内的炎症细胞的免疫活性,其特异性配体通过调节炎性反应而减轻缺血性病理损伤。Atushi〔1〕研究发现,PPARγ的特异性激活配体(BRL-49653)能够减轻肠缺血损伤外,Wayman〔3〕等通过心肌缺血再灌注模型实验同样证实了 PPARγ激活剂能够减轻心肌梗死面积,降低心肌病理损伤,有利于心肌功能的恢复。目前认为,PPARγ所具有的抗缺血性损伤作用主要和其激活后抑制了炎性细胞分泌细胞间黏附分子-1(ICAM-1),肿瘤坏死因子(TNF-α),白细胞介素(IL-8),内皮细胞黏附因子(CD18),肝组织细胞黏附因子-1(MCP-1),基质金属蛋白酶(MMP-2)等细胞因子降低其活性有关。有脑缺血时,淋巴细胞和单巨噬细胞均存在免疫激活现象,并且上述炎性相关因子表达增加后导致脑缺血炎性损伤。

大规模前瞻性的临床试验显示CRP的水平增高是不稳定性动脉粥样硬化疾病发生的危险信号,也预示着缺血性脑梗死患者的预后不良。越来越多的证据表明血清CRP浓度升高与脑梗死的关系,认为其与高血压、糖尿病一样,是脑梗死预后的独立危险因素〔4,5〕。研究显示 CRP水平与急性脑梗死的发生、严重程度及预后呈正相关〔6〕。脑梗死病例中 CRP有显著升高的病例倾向于大面积的梗死及更高的致残率,而 CRP不高的病例则倾向于小面积的梗死〔7〕。本研究 64例患者 CRP浓度比正常对照组显著增高,表明在脑梗死早期,急性时相反应炎症蛋白 CRP是一项比较敏感的检验指标,有着很好的阴性预测意义。

综上,推测脑缺血时 PPARγ表达下调可能参与了脑缺血炎性病理损伤,PPARγ表达下调是脑缺血后炎性反应的原因,并且其下调的幅度与 CRP呈负相关。既然在脑梗死中存在PPARγ表达变化,并且有可能导致脑缺血的炎性损伤,所以从理论上认为对脑梗死患者给予外源性的PPARγ激活配体可减轻脑缺血的炎性损伤。

1 Atushi N,Koichiro W,Hiroshi M,et al.Endogenous PPARgamma mediates anti-inflammatory activity in murine ischemia-reperfusion injury〔J〕.Gastroenterology,2001;120(2):460-9.

2 全国第 4次脑血管病学术会议.脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准(1995)〔J〕.中华神经科杂志,1996;29(6):381-3.

3 Wayman NS,Hattori Y,Mc Donald,et al.Ligands of the peroxisome proliferator-activated receptors(PPAR-gamma and PPAR-alpha)reduce my-ocardial infarct size〔J〕.FASEB J,2002;16(9):1027-40.

4 Rost NS,Wolf PA,Kase CS,et al.Plasma concentration of C-reactive protein and risk of ischemic stroke and transient ischemic attack the Framingham Study〔J〕.Stroke,2001;32(11):2575-9.

5 Price CJS,Warburton EA,Menon DK.Human cellular inflammation in the pathology of acute cerebral ischaemia〔J〕.JNeurol Neurosurg Psychiatry,2003;74:1476-84.

6 彭 军,章军建.急性脑梗死患者 C-反应蛋白水平变化〔J〕.卒中与神经疾病,2006;13(1):45-7.

7 张微微,周小英,黄勇华.不同类型脑梗死患者血清 C-反应蛋白的检测及临床意义〔J〕.中华检验医学杂志,2004;27(11):781-3.