抗IL-13全人源单链抗体的筛选、可溶性表达及鉴定①

张登梅　年四季　叶迎春　杨　燕　于　红　袁　青

(四川医科大学基础医学院,泸州646000)



抗IL-13全人源单链抗体的筛选、可溶性表达及鉴定①

张登梅年四季叶迎春杨燕于红袁青

(四川医科大学基础医学院,泸州646000)

[摘要]目的：筛选特异性好、有体外中和特性的抗IL-13单链抗体，并进行可溶性表达和鉴定。方法：前期课题组构建了大库容量天然单链抗体文库，本研究采用噬菌体展示技术对天然抗体文库进行3轮富集，然后从3轮富集后的文库中采用ELISA进行筛选抗IL-13 阳性单链抗体；将特异性好、亲和力相对较高的阳性单链抗体转入表达载体中进行表达并鉴定。结果：经3轮噬菌体展示富集，有30%左右的克隆子为阳性；经过约500株克隆子筛选，筛选到2株特异性和亲和力相对较高，有体外中和特性的单链抗体；将筛选的单链抗体基因转入表达载体LZ16 中进行了表达，并采用生物大分子相互作用技术、Western blot等进行了鉴定。结论：成功筛选到特异性好、亲和力相对较高并具有体外中和活性的抗IL-13单链抗体。

白细胞介素在嗜酸性和非嗜酸性哮喘中扮演着重要的角色，其中白细胞介素-13(IL-13)是一个密切相关的细胞因子，它是由肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和Th2细胞分泌，最重要的是Th2细胞分泌。IL-13是参与Th2细胞介导的气道炎症中一个关键性的细胞因子[1]，其诱导 B 细胞增殖和分化、促进 IgE 合成、活化嗜酸性粒细胞、延长嗜酸性粒细胞的存活、增加黏液分泌、引起气道高反应(Airway hyperresponsiveness,AHR)和上皮细胞纤维化等，在哮喘的发生中起重要的作用[2，3]。IL-4/IL-13通过激活IL-4Rα，IL-13Rα1组成的异二聚体受体复合物，分享共同的受体机制和信号传导通路，发挥不同的生物学作用[4]，尤其在Th2细胞介导的相关过敏性疾病如支气管哮喘中发挥重要的作用。本研究欲从前期构建的天然全人源抗体文库中筛选特异性好的抗IL-13单链抗体，为后期构建抗IL-4、IL-13双特异性抗体奠定实验基础，为研制治疗过敏性哮喘的抗体药物奠定基础。

1材料与方法

1.1材料pET101、Ni-NTA 亲和层析纯化系统购自Invitrogen 公司；DNA标准分子量为TaKaRa 公司的1 000 bp； 蛋 白 Marker 为TaKaRa 公司的低分子量蛋白 Marker。pCANTAB-5E、大肠杆菌 TG1、辅助噬菌体 M13K07均购自 Gene 公司；抗 M13 HRP标记单克隆抗体购自 Amersham Biosciences公司；Anti-FLAG HRP 标记单克隆抗体购自sigma公司；IL-13Rα1购自sino biological公司。

1.2方法

1.2.1抗 IL-13全人源单链抗体的筛选 本研究前期构建了天然全人源scFv文库，文库容量达到了1.2×108，多样性良好。以生物素化的人IL-13蛋白为抗原，采用噬菌体展示技术对全人源scFv文库进行了3轮富集，随机挑取3轮富集后的文库克隆子进行噬菌体扩增，具体方法参见[5]，扩增后的噬菌体抗体用于ELISA 检测。即包被液(50 mmol/L NaHCO3/Na2CO3，pH9.6) 稀释人IL-13 蛋白至30 μg/ml，包被稀释的抗原于酶标板内4℃过夜，次日洗涤酶标板后，用封闭液37℃封闭1 h，加入扩增后的噬菌体抗体孵育，用二抗anti-M13-HRP标记单克隆抗体和底物TMB进行显色(15~30 min)，在OD450读数。

1.2.2筛选的单链抗体特性分析指纹图谱分析：将ELISA阳性的单链抗体克隆子进行PCR扩增，采用BstN I酶切检测筛选的阳性单链抗体序列的多样性。

特异性：将筛选的OD450相对较高的单链抗体采用ELISA进行特异性分析。分别包被30 μg/ml人IL-13、人IL-4、人TSLP于酶标板上，封闭后加入噬菌体抗体孵育后，加入二抗anti-M13-HRP标记单克隆抗体和底物TMB进行显色(15~30 min)，在OD450读数。

竞争ELISA：筛选特异性较好的单链抗体进行竞争ELISA实验，预测人IL-13受体(IL-13Rα1)和人IL-13、抗IL-13 scFvs和人IL-13结合是否为同一抗原表位，从而判断抗IL-13 scFvs是否能封阻IL-13 与IL-13Rα1的结合。包被30 μg/ml IL-13 纯化蛋白于酶标板内4℃过夜，封闭液封闭酶标孔后，加入1∶1比例的噬菌体抗体和IL-13Rα1(分别用1、2 μg/ml)，用1∶1比例噬菌体抗体和PBS混合物作为对照，37℃湿温孵育1 h后，洗涤后加入 HRP 标记抗 M13 单克隆抗体，37℃湿温孵育 1 h，用TMB 显色液显色(15~30 min)，在OD450读数。

1.2.3单链抗体基因中琥珀终止密码子的校对对筛选的2个特异性和体外中和效果较好的阳性单链抗体进行测序，结果显示在单链抗体第32位氨基酸处出现了琥珀终止密码子。由于在E.coli TG1中，琥珀终止密码子可以部分被抑制，所以在pCANTAB 5E载体体系中筛选的带有琥珀终止密码子的单链抗体会被通读而表达，从而ELISA结果为阳性结果。将琥珀终止密码子进行单点突变，终止密码子突变为氨基酸Trp (W)。

1.2.4单链抗体基因的可溶性表达本实验室将PUC质粒进行改进用于单链抗体表达，载体(LZ16)中引入了FLAG和His-tag标签，表达于单链抗体的C端，便于单链抗体的纯化和检测。将琥珀终止密码子校对后的单链抗体基因进行酶切后与LZ16连接，转化到E.coli DH5αF′中。测序验证插入基因正确后，于LBAG (LB培养基含100 μg/ml 氨苄青霉素和2%葡萄糖)37℃培养阳性转化菌于OD600为0.6，离心后用LBA(LB培养基含100 μg/ml 氨苄青霉素)重悬沉淀，加入终浓度 1 mmol/L 的IPTG诱导表达5h，收集沉淀，超声破碎细菌后，离心收集上清液用于单链抗体的纯化和鉴定。

1.2.5单链抗体的鉴定Western blot:SDS-PAGE 电泳表达的单链抗体蛋白，电转PVDF膜，封闭液封闭后，加入HRP标记抗FLAG抗体(1∶5 000稀释)，化学发光法检测表达的单链抗体蛋白。大分子相互作用技术：将人IL-13蛋白生物素化后固定于SA sensor上，加入纯化的不同浓度的抗IL-13单链抗体，BLITZ仪器检测抗原抗体的相互作用，计算抗IL-13单链抗体的亲和力。

2结果

2.1抗 IL-13全人源单链抗体的筛选 以人IL-13蛋白为抗原，采用噬菌体展示技术将天然抗体文库进行了3轮富集，随机挑取经3轮富集展示的单克隆子进行小量表达后，ELISA鉴定表达的单链抗体与人IL-13是否结合。结果显示：30%左右的克隆子ELISA结果为阳性，可与人IL-13有良好的结合作用(图1)。

2.2筛选的单链抗体特性分析将筛选的阳性单链抗体进行PCR扩增后，BstN I 酶切后显示挑取的16个单克隆子中大部分单链抗体序列是不相同的，具有一定的多样性(图2)。将序列不相同的单链抗体进行小量表达后进行竞争ELISA，结果显示有2株单链抗体可与IL13Rα1竞争性地与IL-13结合，说明单链抗体和IL-13、IL13Rα1和IL-13结合的抗原表位是相同的，表明筛选的2株单链抗体具有体外中和特性(图3)。分析具有体外中和特性的2株单链抗体的特异性，结果这2株单链抗体显示了良好的特异性(图4)。

图1　ELISA 检测 经三轮富集后文库单链抗体与人IL-13的结合作用Fig.1　Test binding of IL-13 and scFvs from antibody library enriched for three rounds by ELISA

图2　指纹图谱分析筛选的阳性单链抗体序列的多样性Fig.2　Analysis the diversity of sequence of positive scFvs by fingerprint

图3　竞争ELISA 检测抗IL-13 scFv、 IL-13 Rα1竞争性地与人IL-13的结合Fig.3　Detection of IL-13 scFv and IL-13 Rα1 competitive binding to human IL-13 by competitive ELISA

图4　ELISA检测抗IL-13单链抗体的特异性Fig.4　Detection of the specificity of scFvs against IL-13 by ELISANote：The proteins of human IL-13，IL4，TSLP were coated on the wells of ELISA plates and the scFv1，scFv2 against IL-13 were added.

2.3单链抗体基因的可溶性表达对特异性好，并

图5　SDS-PAGE和Western blot检测纯化的scFv1和scFv2Fig.5　Detection of purified scFv1 and scFv2 by SDS-PAGE and Westrn blotNote: M.BenchMarkTMpre-stained protein ladder(Invitrogen);A.SDS-PAGE detection of purified scFv1 and scFv2;B.Westem blot detection of the expressed scFv1 and scFv2.

图6　生物大分子相互作用技术(BLITZ)检测scFv1 和scFv2的亲和力Fig.6　Biomolecular interaction analysis (BLITZ) detection of the affinity of scFv1 and scFv2Note: A.scFv1; B. scFv2.

具有体外中和特性的2株单链抗体进行了序列测定，结果发现在第32位氨基酸处出现了琥珀终止密码子，分析2株单链抗体序列，只有3个氨基酸位点不相同。在噬菌体展示技术对抗体文库筛选的过程中，可能由于表达的外源基因对宿主的毒性作用，导致部分筛选的单链抗体发生突变而带有琥珀终止密码子，而在E.coli TG1中，琥珀终止密码子可以部分被抑制，所以在pCANTAB 5E载体筛选体系中带有琥珀终止密码子的单链抗体会被通读而表达，从而ELISA结果为阳性。

采用单点突变的方法将琥珀终止密码子进行校正，校正后的氨基酸为W。将校正后单链抗体转入表达载体LZ16中进行可溶性表达并对表达产物进行纯化，结果显示，在26 kD处出现了目的条带(图5A)。由于是将表达的细菌进行全菌超声破碎，然后离心收集上清采用Ni-NTA亲和树脂进行纯化，Ni-NTA 对细菌的一些蛋白可能会有非特异性结合，所以导致纯化出现了非特异性的条带。为了验证在26 kD出现的条带即为抗IL-13单链抗体条带，采用Western blot 对表达的单链抗体进行了鉴定，由于表达载体上设计有His-tag和FLAG标签，进行Western blot 时用的是anti-FLAG HRP标记的抗体，结果显示，在26 kD处有单一条带产生，说明表达纯化的单链抗体正确(图5B)。

2.4抗IL-13单链抗体亲和力采用生物大分子相互作用技术(BLITZ)对表达纯化的scFv1 和 scFv2进行了系列稀释，与固定在SA sensor上的人IL-13蛋白相互作用，图6显示纯化的单链抗体与人IL-13可良好的结合，由于这两株单链抗体氨基酸序列只有3个不相同，计算其亲和力，其亲和力相差不大，scFv1 为6.073×10-7，scFv2 为2.267×10-7(图6)。

3讨论

IL-13是一种多效的Th2型细胞因子，通过刺激杯状细胞分化、上皮细胞产生黏液，激活成纤维细胞，引起气道高反应[6,7]。在哮喘的小鼠模型中，已经证明 IL-13基因的过度表达会引起气道炎症、增加黏液分泌、上皮细胞纤维化、产生趋化因子[1]。抗IL-13单克隆抗体药物已进入临床试验，但也只针对Th2细胞介导的气道炎症或血液嗜酸性粒细胞型哮喘有效[4,8-10]。有研究显示：在局部过敏原刺激的鼻腔中，阻断性抗IL-13单克隆抗体能够抑制IL-13分泌，但没有显著减少嗜酸性粒细胞数或减轻鼻部症状[11]。通过深入研究IL-13在哮喘等过敏性炎症疾病中的信号传导通路，发现IL-13主要通过结合IL-13Rα1/IL-4Rα异二聚体发挥作用，IL-13Rα1/IL-4Rα能够同时结合IL-13、IL-4进行信号传导[12]。因此，能够同时封阻IL-4与IL-13的信号通路，制备双特异性全人源抗体为过敏性炎症提供更好的疗效。

从天然全人源抗体文库中筛选出的单链抗体一般亲和力比较低，通过本研究从前期构建的天然全人源抗体文库中筛选出了2株特异性较好并具有体外中和特性的抗IL-13单链抗体，其亲和力为10~7左右。后期将对其亲和力进行进一步进化，为构建全人源抗IL-4、IL-13双特异性抗体奠定实验基础。

参考文献：

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[5]袁青,黄黎,郭夕源,等.IL-4、IL-13蛋白表达及抗IL-4、IL-13人源单链抗体的筛选 [J]. 中国免疫学杂志,2013,29(6):644-648.

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[收稿2015-07-25修回2015-08-17]

(编辑许四平)

[关键词]IL-13；全人源单链抗体；噬菌体展示

Selection,soluble expression and identification of full human scFvs against IL-13

ZHANGDeng-Mei,NIANSi-Ji,YEYing-Chun,YANGYan,YUHong,YUANQing.TheSchoolofBasicMedicalSciences,SichuanMedicalUniversity,Luzhou646000，China

[Abstract]Objective:To select specific and neutralizing scFv against IL-13 and soluble expression and identification them.Methods: In our previous study the scFv library were constructed,and here the scFv library was enriched and the positive scFv were screened from the enriched scFv library for three round.The specific positive scFvs with better affinity were ligated with expression vector for expression and identification.Results: After three rounds of enrichment,30% of clones were positive.The two specific scFvs with better affinity and neutralization were selected from almost 500 clones and then ligated with expression vector LZ16 for soluble expression.The expressed scFvs were identified by western blot and biomolecular interaction analysis.Conclusion: The specific scFvs against IL-13 with better affinity and neutralization had been selected successfully.

[Key words]IL-13;Human scFv;Phage display

通讯作者及指导教师：袁青(1978年-)，女，教授，主要从事重组抗体研究，E-mail:yuanqing_ok@hotmail.com。

作者简介：张登梅(1990年-)，女，在读硕士，主要从事分子免疫学研究。

中图分类号R392.11
①本文为四川省科技厅项目(2015JY0218,013SZZ005)和四川省教育厅项目(13ZB0262)。

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)01-0065-04

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.014