Th1/Th2细胞因子的平衡与实验性肺间质纤维化

谷 秀,刘宏博,张晓晔,李胜岐,佐久间勉

(1中国医科大学附属盛京医院,沈阳 110004；2日本金泽医科大学)

目前,特发性肺间质纤维化发病机制不清,也无有效的治疗方法。许多研究证实该病过程中存在细胞因子平衡失调,而且细胞因子在该病的发病过程中起重要作用。2007年 2月 ～2008年 4月,我们通过探讨特发性肺纤维化过程中细胞因子与核因子-κB(NF-κB)的关系,为阐明肺纤维化的发病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用 C57BL/6CrSlc小鼠 75只,8周龄,雌性,体质量 17～20 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验药品:盐酸博莱霉素 A5(平阳霉素)(天津市太和制药有限公司),甲基强地松龙(美国普强药厂比利时分厂),P65的反义寡核苷酸(上海生物工程公司),SABC试剂盒(武汉博士德公司),双抗夹心 ELISA试剂盒(深圳晶美公司),羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物技术研究所)。

1.2 小鼠肺纤维化模型制备和实验动物分组 实验组小鼠气管内滴入博莱霉素 A 55 mg/kg(B组)建立肺纤维化模型,对照组(A组)小鼠气管内滴入等量的生理盐水。在气管内滴入博莱霉素前 6 h和滴入后 5 d分别经尾静脉注射 P65反义寡核苷酸 900μg/只(C组),在气管内注入博莱霉素后 1 d和5 d分别经尾静脉给予P65反义寡核苷酸 900μg/只(D组),P65反义寡核苷酸溶于生理盐水 200μl中,P65反义寡核苷酸的序列为 5′-GAAACAGATCGTCCATGGT-3′[1]。对照组和模型组在上述相同的时间经尾静脉注射等量的生理盐水。E组为甲基强地松龙组,分别于气管内注入博莱霉素前和注入后的第 1、2天经尾静脉注射甲基强地松龙 150 mg/kg(溶于 200μl生理盐水中)。A、B、C、D、E组每组各 24只小鼠,分别于 3、7、14、28 d各处死 6只。

1.3 标本采集及检测 腹腔注射 1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉小鼠后,眼眶静脉放血处死动物,开胸,结扎右主支气管后取出右肺,称量肺湿重,-70℃保存,待测羟脯氨酸含量(制成 10%匀浆,3 000 g/min离心 10 min,取上清测定)。向左肺灌注 10%甲醛,直至肺表面平滑,结扎左支气管,取出左肺,放入 10%甲醛中固定,常规石蜡包埋,切片,染色,病理检查。根据 Szapiel等[2]提供的方法确定肺泡炎及肺纤维化的程度。免疫组化方法检测肺组织 NF-κB的表达,用 SABC法试剂盒进行检测,操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.4 肺泡灌洗液 IFN-γ及 IL-4的检测 气管插管,用预热至 37℃的 PBS液灌洗支气管肺泡,并收集肺泡灌洗液。每次注入 2.5～5.0 ml,反复冲洗 2次后吸出,共 3次,回收率达 90%以上。回收的灌洗液于4℃、1 500 r/min离心 10 min,留取上清液,-70℃冻存。ELISA法测定 IFN-γ及IL-4的蛋白含量。

1.5 统计学方法 采用采用SPSS10.0软件进行统计分析,结果以±s表示,以 P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 肺组织病理形态学 B组 3 d后即可见少量炎症细胞渗出,7 d时达到高峰,可见弥漫性肺泡炎改变；14 d可见肺泡间隔明显增厚,28 d肺纤维化达到高峰,肺泡结构消失,形成广泛明显的肺纤维化。E组的病理改变与B组基本相同。C、D组14 d时未见明显的肺组织异常,无明显的肺纤维化形成,28 d时有极少量的纤维化形成。

2.2 NF-κB免疫组化结果 见表1。

表1 各组 NF-κB免疫组化核染色阳性百分比(%,±s)

表1 各组 NF-κB免疫组化核染色阳性百分比(%,±s)

注:与 A组比较,*P＜0.01,△P＜0.05

组别n 3 d 7 d 14 d 28 d A组 6 7.3±1.1 7.8±2.0 7.4±1.4 7.6±0.8 B组 6 34.7±11.2*45.6±3.9* 19.7±1.8△ 14.7±2.3△C组 6 14.6±4.4 15.6±5.0 11.2±3.4 7.9±1.2 D组 6 22.5±1.3*25.6±3.3*15.8±2.7△ 12.6±0.9 E组 6 29.4±4.2*36.7±1.2*21.4±3.7△ 11.6±1.9

2.3 肺泡灌洗液中细胞因子检测结果 见表2。

表2 各组肺泡灌洗液中 IL-4、IFN-γ水平比较(pg/ml,±s)

表2 各组肺泡灌洗液中 IL-4、IFN-γ水平比较(pg/ml,±s)

注:与 A组比较,*P＜0.05,△P＜0.01；与 B组比较,#P＜0.05

组别 n IL-4IFN-γIIFN-γ/IL-4 7 d 28 d 7 d 28 d 7 d 28 d A组 6 17.9±1.4 20.5±9.1 189.6±6.3 190.5±2.3 10.6 9.3 B组 6 51.7±1.5△ 68.9±1.1△ 143.2±12.4 132.7±1.9 2.8* 1.9*C组 6 33.2±0.8△# 35.5±2.7△# 165.1±9.1 177.5±9.0 5.0*# 5.0*#D组 6 43.7±2.2△# 39.6±3.5△# 158.0±1.3 161.6±3.2 3.6*# 4.1*#E组 6 49.6±2.1△ 41.0±6.8△ 151.7±4.2 139.2±8.3 3.1* 3.4*

2.4 肺组织羟脯氨酸测定结果 见表3。

表3 肺组织羟脯氨酸的测定(mg/g,±s)

表3 肺组织羟脯氨酸的测定(mg/g,±s)

注:与 A组比较,*P＜0.05；与 B组比较,△P＜0.05

A组 6 1.3 4±0.1 2 1.4 0±0.3 1 1.4 1±0.4 4 1.4 3±0.3 2 B组 6 1.3 9±0.2 6 2.0 7±0.3 5* 2.3 3±0.1 4* 3.0 7±0.1 7*C组 6 1.4 1±0.3 5 1.6 6±0.3 3*△ 1.8 5±0.1 9*△ 1.9 1±0.2 8*△D组 6 1.3 8±0.2 1 1.9 0±0.3 7* 2.1 3±0.3 4* 2.4 5±0.3 9*△E组 6 1.4 0±0.2 2 2.1 1±0.1 8* 2.3 9±0.3 2* 2.8 9±0.2 9*

3 讨论

经气管注入博莱霉素建立肺纤维化的动物模型已被广泛应用。本研究病理学改变早期肺泡炎明显,第 7天开始出现肺纤维化,至第 28天纤维化已成为主要的病理改变。NF-κB是一种多功能的核转录因子,具有广泛的生物学活性,激活后可促进细胞因子、黏附分子、趋化因子等的转录。NF-κB与呼吸系统多种疾病密切相关[3]。IFN-γ是典型的 Th1类细胞因子,具有抑制成纤维细胞增生及胶原聚集等作用,并且可以拮抗 Th2类细胞因子 IL-4、TGF-β的作用。所以 IFN-γ的相对缺乏可能与纤维母细胞激活、胶原沉积和瘢痕形成有关。而 Th2细胞来源的因子如 IL-4可扩大炎症反应,引起肺结构的重塑,刺激肺成纤维细胞增生,伴有胶原和纤维素沉积增多,引起肺泡壁基底膜增厚和弥漫性上皮下纤维化[4,5]。以 IFN-γ/IL-4来衡量特发性肺纤维化中 Th1/Th2之间的平衡,其细胞因子的表达呈现出 Th2方向的偏移状态,Th2类的强势表达在特发性肺纤维化的过程中具有重要意义。这些变化与 NF-κB的活化密切相关,NF-κB的活化使 IL-4表达增强,可能是肺纤维化早期肺泡炎发生的关键环节,因此提前干预 NF-κB可能明显减轻博莱霉素引起的急性毒性反应。

根据 Th1和 Th2细胞在免疫调节中的中心作用,通过调节 Th1/Th2平衡阻断某些疾病的恶性循环,可以为某些疾病的治疗提供新的治疗策略[6]。应用 NF-κB的反义寡核苷酸可以抑制 NF-κB的活性,尤其在给予博莱霉素前应用,可以更明显抑制早期肺泡炎的出现或防止肺泡炎的持续发展,从而预防或减轻肺纤维化的产生。但应用 NF-κB的反义寡核苷酸组的 NF-κB的活性仍然比对照组高,推测还可能与存在其他转化因子有关。

综上所述,NF-κB活化是 Th1/Th2细胞因子失衡的主要原因,干预 NF-κB活化可以使 Th1/Th2细胞因子失衡得到一定程度的逆转,并可以一定程度上减轻肺纤维化的程度。

[1]Zhang XY,Shimura S,Masuda T,et al.Antisense oligonucleotides to NF-kappaB improve survival in bleomycin-induced pneumopathy of the mouse[J].Am JRespir Crit Care Med,2000,162(4 Pt 1):1561-1568.

[2]Szapiel SV,Elson NA,Fulmer JR,et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude,athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis,1979,120(4):893-899.

[3]Wright JG,Christman JW.The role of nuclear factor kappa B in the pathogenesis of pulmonary diseases:implications for therapy[J].Am J Respir Med,2003,2(3):211-219.

[4]Sharma R,Guleria R,Pande JN.Idiopathic pulmonary fibrosis:newer conceptsand management strategies[J].Indian JChest Dis Allied Sci,2003,45(1):31-49.

[5]Costabel U,Guzman J.Bronchoalveolar lavage in interstitial lung disease[J].Curr Opin Pulm Med,2001,7(5):255-261.

[6]Chung MP,Monick MM,Hamzeh NY,et al.Role of repeated lung injury and genetic background in bleomycin-induced fibrosis[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2003,29(3 Pt 1):375-380.