10株牛源非结核分枝杆菌16S rRNA基因序列分析

葛淑敏，钱爱东，王铁风

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022)

非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacteria，NTM)是指除结核分枝杆菌及麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。NTM广泛存在于自然界，如空气、土壤、动物体表及体液等[1]。致病性较弱，可为呼吸道的正常寄生菌，但可在局部或全身抵抗力下降时成为条件性致病菌[2]。为进一步了解牛群中NTM感染情况，本实验对10株牛源NTM菌株进行了16S rDNA基因序列分析鉴定。

1 材料和方法

1.1 实验材料 10株牛源NTM分离株由本室分离保存(来自吉林省)，分别命名为 N1～N10，其中N3、N8、N9与N10分离自牛颌下淋巴结样品，其他分离株均分离自牛肠系膜淋巴结样品。

1.2 DNA提取 采用酚-氯仿抽提法提取DNA，参照常规方法进行。提取的DNA于-20℃保存。

1.3 16S rDNA基因扩增 根据16S rRNA基因高变区序列[3]设计合成1对引物(由上海生物技术有限公司合成)，上游引物P1：5'-CACATGCAAGTCGA ACGGAAAGG-3'和下游引物P2：5'-GCCCGTATCG CCCGCACGCT-3'；扩增16S rRNA基因5'端约570 bp左右片段。PCR反应体系为 20 μL：10×ExTaq Buffer(含 Mg2+)2 μL、dNTP Mixture(2.5 mmol/L)1.5 μL、上、下游引物 P1/P2(10 μmol/L)各 0.5 μL、DNA 模板 1 μL、ExTaq(5 u/μL)0.25 μL，H2O 14.25 μL。PCR扩增程序为：95℃5 min；94℃30 s、63℃ 30 s、72℃1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.4 PCR扩增产物纯化及序列测序 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收，并由宝生物工程(大连)有限公司测序。

1.5 DNA序列分析 将16S rDNA测序结果与GenBank中登录的相关序列比较[4]。本实验所用标准16S rDNA序列分别为：母牛分枝杆菌(M.vaccae)，登录号：AF480591.1；新金色分枝杆菌(M.neoaurum)，登录号：FJ172309.1；偶发分枝杆菌(M.fortuitum)，登录号：DQ973806.1及浅黄分枝杆菌(M.gilvum)，登录号：AB491971.1。

2 结果与讨论

2.1 16S rDNA片段PCR扩增结果 10株NTM菌株均扩增到一约570 bp目的片段,与预期扩增片段大小相符。

2.2 NTM菌株16S rDNA序列分析 基于16S rDNA序列分析是细菌系统分类的“金标准”[5]，本实验测定NTM菌株16S rDNA片段5'端500 bp序列，即含有属特异性的保守区域，又含有种特异性的高变区,分别是位于120位～254位核苷酸和位于388位～490位核苷酸的区域。DNA软件分析显示：10株 NTM菌株中 N4、N5与 N6，N3与 N1016S rDNA序列重合部分完全一致,其他菌株16S rDNA序列相似水平分别为95.1%～99.8%,具有较好的同源性。各菌株序列与GenBank中登录的最相似的序列见表1。

表1 16S rDNA序列与GenBank中登录的相同或最相似序列的比较Table 1 Comparisons of 16S rDNA sequences with that from GenBank

2.3 16S rDNA序列构建系统进化分析 将10株NTM菌株与GenBank中登录的4株NTM标准菌株的16S rDNA 5'端570 bp左右序列构建系统进化树(图1)。分析表明各菌株之间均得到良好区分。

图1 用16S rDNA序列构建的系统发育树Fig.1 16S rDNA sequence-based Phylogenetic tree

2.4 NTM菌株的鉴定 10株NTM菌株的16S rDNA的测序结果与GenBank中标准株序列比较，结果显示：N1为浅黄分枝杆菌；N2为偶发分枝杆菌；N3与N10为母牛分枝杆菌；N4、N5、N6、N7为新金色分枝杆菌；N8与新金色分枝杆菌，N9与偶发分枝杆菌同源性分别为98.6%～98.8%,显示其亲缘关系非常相近，N8、N9是否为分枝杆菌新种或是这些已知分枝杆菌的亚种还需要进一步的实验确认。本研究应用16S rDNA序列分析证实10株NTM中N2为偶发分枝杆菌，偶发分枝杆菌是临床上常引起人肺部感染的NTM，其他一些菌株虽属条件致病菌，也有学者报导可引起人类的感染。

NTM感染可以具有与结核病相似的临床表现，但在治疗和预防与结核病有明显不同。不同NTM种对药物敏感性也不同，所以临床分枝杆菌感染的菌种鉴定不仅在分枝杆菌感染的流行病学方面,而且在临床诊治方面有重要意义[6]。迄今，我国动物NTM相关研究相对较少，相关报道主要集中在人医临床分离与药敏实验。日本曾报道人、猪、牛等多种动物体内可分离出NTM，因此认为动物作为传染媒介的可能性有探讨的必要。林世平等报道从广东地区174份牛鼻腔分泌物标本中分离出88株菌，其中NTM阳性率高达50.5%，提示NTM在广东地区可能广泛存在于自然界[7]。

本研究结果显示吉林地区的NTM临床分离株的种类与国内外报告的临床分离NTM的种类有明显的不同,这可能与地域和气候的差异密切有关。本研究为追踪NTM疾病可能的传染源、了解其致病性及对家畜NTM疾病的防制提供了实验依据。

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