牛分枝杆菌mpb51-63融合基因的克隆及其原核表达

李璐璐，王春芳,3，任 飞，刘新宇，宁浩然，刘 磊，李冰洁，姜秀云,3*，何昭阳

(1.吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；3.教育部动物生产及产品质量安全重点实验室，吉林 长春 130118)

牛结核病(Bovine tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种慢性、消耗性人兽共患传染病。由于缺乏特异而敏感的诊断试剂及有效的预防疫苗，近年来该病在全球范围内的流行呈上升趋势[1]。MPB51[2]和MPB63[3]是结核杆菌的主要分泌蛋白。其中，MPB51存在于CD4+T和CD8+T细胞免疫优势抗原表位[4]，并且在免疫诊断中具有高度的特异性[5]。MPB63只存在于结核杆菌复合群中，能够与豚鼠阳性血清产生强烈的反应[6]。两者可以作为结核病的诊断抗原及疫苗的候选抗原。

研究表明，以M.bovis多基因融合表达的融合蛋白作为诊断抗原，提高了诊断的敏感性和特异性[7-8]。另外，融合蛋白免疫的小鼠血清抗体水平高于卡介苗免疫，并且免疫效果显著高于单一抗原[9]。为提高单一抗原的抗原性，采用重叠延伸(SOE)拼接PCR技术将M.bovis mpb51和mpb63基因融合，并在大肠杆菌中进行表达，为进一步研究mpb51-63融合基因及其表达产物作为新型DNA疫苗、亚单位疫苗及诊断抗原奠定基础。

1 材料和方法

1.1 载体、质粒与细菌株 pMD18-T为TaKaRa公司产品；pGEM-T-51、pGEM-T-63、pET28a(+)、E.coliJM109及BL21(DE3)均由本实验室保存。

1.2 主要试剂 Pyrobest DNA Polymerase、LATaq DNA聚合酶、BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；辣根过氧化物酶(HRP)购自Roche公司产品；牛结核多克隆抗体为临床结核病牛血液分离的血清；HRP标记兔抗牛IgG二抗由本实验室制备并保存。

1.3 引物的设计与合成 根据mpb51、mpb63的基因序列，设计如下引物：P1：5'-TAGGATCCACCA TGGCCCCATACGAGAA-3'； P2： 5'-CGATCCGCCA CCGCCAGAGCCTCCACCTCCTGAACCGCCTCCAC CGCGGATCGCACC-3'； P3： 5'-GGTGGAGGCGGTT CAGGAGGTGGAGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGG CCTATCCCATCACC-3'；P4：5'-GCGAATTCTTACG GCTCCCAAA-3'。上述引物由TaKaTa公司合成。

1.4 目的基因扩增、克隆及序列分析 以pGEM-T-51、pGEM-T-63为模板，分别以P1和P2、P3和P4为引物，利用Pyrobest DNA Polymerase对mpb51与mpb63基因进行扩增。以mpb51和mpb63基因的PCR纯化产物为模板，以P1和P4为引物，并以LATaqDNA聚合酶扩增mpb51-63。PCR产物经纯化后，与pMD18-T连接，构建重组质粒pMD-51-63，并转化至E.coliJM109中。提取重组质粒，并进行酶切鉴定。阳性克隆由TaKaRa公司测序。

1.5 原核重组表达质粒的构建及鉴定 pMD-51-63和pET28a(+)均以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切，纯化产物以T4 DNA Ligase连接，并转化至感受态E.coliBL21(DE3)中。提取质粒并酶切鉴定。

1.6 mpb51-63基因的表达与分析 将重组菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，至OD600nm为0.7～0.8，以 IPTG诱导。每隔1 h取菌液，共7次。将诱导各时间收获的菌液离心，收集菌体，进行SDS-PAGE分析。诱导表达7 h的菌体蛋白经SDS-PAGE后，电转移至PVDF膜上，以M.bovis多克隆抗体为一抗，HRP标记兔抗牛IgG抗体为二抗，联苯胺(DAB)为底物，进行western blot分析。

2 结果与讨论

2.1 目的基因的PCR扩增 mpb51、mpb63及mpb51-63基因扩增产物的电泳结果如图1所示，mpb51、mpb63和mpb51-63基因片段分别约为850 bp、440 bp和1300 bp，均与预期大小一致(图1)。

图1 mpb51、mpb63和mpb51-63基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of mpb51,mpb63 and mpb51-63 gene

2.2 重组质粒的鉴定与mpb51-63融合基因的序列分析 以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切pMD-51-63，得到约2600 bp的pMD-18-T线性片段和约1300 bp的插入片段。序列分析证实，mpb51-63融合基因为1236 bp，与预期大小一致。但融合蛋白的氨基酸推导序列在M51V、I265N和N400D发生了突变，推测可能对其抗原性会产生影响。

2.3 原核重组表达质粒的鉴定与表达 pET-51-63经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后，得到约1300 bp的插入片段。pET-51-63经IPTG诱导表达，融合蛋白的相对分子量约为46 ku，其表达量随诱导时间的延长而增加，诱导3 h时达到高峰。而空质粒对照菌则未见该蛋白表达(图2)。

2.4 融合蛋白的抗原特性分析 mpb51-63融合基因表达产物的western blot分析结果显示46 ku处有一条明显的蛋白印迹带(图3)，表明该融合蛋白具有较好的M.bovis抗原反应性。

图2 原核表达质粒在E.coliBL21中的表达Fig.2 SDS-PAGE analysis of mpb51-63 gene expression in E.coliBL21

图3 原核表达产物的western blot鉴定Fig.3 Western blot analysis of the expression product of the recombinant plasmid of mpb51-63 gene

本研究选择M.bovis mpb51和mpb63两个保护性抗原基因，采用SOE PCR技术将mpb51和mpb63基因以45个核苷酸相连接，在MPB51和MPB63之间插入15个氨基酸(Gly4Ser)3的连接肽，从而保证各自抗原的空间结构及免疫活性。本研究克隆了mpb51-63融合基因，序列分析证实碱基序列无插入和缺失现象，阅读框架正确。在此基础上，构建了pET-51-63，并且在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究牛结核病的诊断试剂、亚单位疫苗及DNA疫苗奠定了基础。

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