应用毛发PCR法检测猕猴TRIM5基因序列CypA转座子插入的TRIMCyp嵌合基因型

汤艳东，于长青，刘晓明，崔多英，那 雷，饶军华，季 芳，吕晓玲，郑永辉，周建华*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001；2.广东省昆虫研究所华南灵长类研发中心，广东 广州 510260；3.北京动物园，北京 100044；4.东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；5.Microbiology and Molecular Genetics,Michigan State University,MI48824,USA)

Tripartite motif protein 5-α (TRIM5α)为一种组成型表达的胞浆蛋白。TRIM5α结合逆转录病毒的衣壳蛋白(Capsid，CA)，主要限制病毒进入胞浆后的脱壳，并将TRIM5α-CA靶向于蛋白酶体而降解[1]。TRIM5α同源基因存在于灵长类动物中[2-3]。在一些猕猴属灵长类动物中，TRIM5基因座发生天然的CypA转座子插入突变，产生TRIM5α-CypA嵌合基因(TRIMCyp)。这种插入突变使TRIM5α结合CA结构域的构象发生变化，失去了限制HIV-1复制的作用[4]。利用TRIMCyp基因型宿主，可使HIV-1较易突破宿主限制性，为研究逆转录病毒跨种间传播和建立新型艾滋病动物模型提供独特平台。

猕猴属的食蟹猴和恒河猴是研究艾滋病的主要非人灵长类模型动物。国外报道在这两种猴中已发现了TRIMCyp基因突变个体，却尚未在中国恒河猴中找到TRIMCyp基因型。国内亦未见食蟹猴携带TRIMCyp基因的研究报道。因此，有必要开展中国猕猴属TRIMCyp基因存在情况调查，为艾滋病疫苗免疫保护性评价和治疗药物筛选提供可靠易感实验动物的战略资源储备。本研究建立了从动物毛发中检测TRIMCyp基因的PCR方法。

1 材料和方法

1.1 实验材料 平顶猴、食蟹猴毛发取自华南灵长类研究开发中心；恒河猴毛发为实验室提供，毛发样品于-20℃保存；毛发基因组提取试剂盒DNA IQTMSystem购自Promega。LATaq酶、DNA Marker和dNTP均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 引物设计 分别根据TRIM5α第6外显子和3'UTR序列(包含第7和第8外显子序列)设计PCR引物。上游引物P1在第6外显子上，序列为：CATGACCTTGAAGAAGCC；下游引物P2在3'UTR上，序列为：TAGCATATCCATCACCTCAAAT。引物由Invitrogen公司合成。

1.3 毛发中染色体DNA提取及PCR扩增 取带有毛囊的毛发1根～2根，按照毛发基因组提取试剂盒DNA IQTMSystem的说明书，提取染色体DNA。以提取的DNA为模板，通过PCR扩增目的片段，反应条件为：95℃ 5 min；95℃40 s、64℃40 s、72℃2.5 min，35个循环；72℃10 min。

2 结果与讨论

2.1 平顶猴TRIMCyp嵌合基因样品检测结果 由于CypA插入于第8外显子后的3'UTR，在TRIM5α第6外显子和3'UTR序列设计引物，无CypA插入的纯合体PCR扩增产物片段预期为2343bp；而杂合突变体则为2343 bp和3110 bp。根据报道，平顶猴均为TRIMCyp基因型。以3只平顶猴毛发DNA，以及分别从1只平顶猴和1只已知TRIM5α基因纯合恒河猴白细胞DNA进行PCR扩增。结果显示，平顶猴和恒河猴白细胞DNA样品分别扩增出大小约为3100 bp和2400 bp的条带，与预期TRIMCyp基因型和TRIM5α基因型相符。3份平顶猴毛发DNA样品均为3100 bp的目的片段(图1)。对扩增的目的片段进行克隆后的测序结果证实了该PCR产物为TRIMCyp。检测的结果与报道结果相符，表明这是平顶猴易感HIV-1的主要原因[5]。但是由于中国平顶猴数量稀少，做为濒危野生动物，不适宜于常规HIV-1感染实验动物。

图1 平顶猴毛发DNA样品PCR检测TRIMCyp突变结果Fig.1 PCR detection of TRIMCypfromMacaca nemestrinagenomic DNA from hair follicle and blood

2.2 恒河猴TRIMCyp突变个体检测结果 为检测TRIMCyp基因型在恒河猴中的存在情况，本研究以5只恒河猴毛发DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物均为大小为2400 bp的TRIM5基因型条带，即5只恒河猴均为TRIMCyp阴性个体。同样，平顶猴和TRIMCyp突变阴性恒河猴白细胞DNA样品的对照也为阴性(图2)。据报道，印度恒河猴TRIMCyp变异率占17%[6]，本研究采集的5只四川地区恒河猴样品，均未检测出TRIMCyp的纯和或杂合突变。这可能由于采集样品数量不足或者中国恒河猴品系的差异造成，尚需进一步扩大样本数量，以证实中国恒河猴是否存在TRIMCyp基因型。

图2 恒河猴毛发DNA样品PCR检测TRIMCyp突变结果Fig.2 PCR detection of TRIMCyp Rhesus macacagenomic DNA extracted from hairs follicle

2.3 食蟹猴TRIMCyp嵌合基因型检测结果 虽然食蟹猴是艾滋病研究的主要动物模型之一，并有检出TRIMCyp基因型个体的报道，但在群体中比例不详[7]。目前，国内尚无食蟹猴TRIMCyp嵌合基因型的报道。本实验对7只食蟹猴进行了TRIMCyp嵌合基因型的检测，结果显示，其中4只为TRIM5基因型，1只为TRIMCyp基因纯合子个体，2只为TRIMCyp基因杂合子个体(图3)。为证实毛发PCR检测的可靠性，分别从这7只食蟹猴的白细胞中提取染色体DNA进行PCR扩增，结果显示，血液样品检测的基因型与毛发样品测试结果一致(图4)。

图3 食蟹猴毛发DNA样品PCR检测TRIMCyp突变结果Fig.3 PCR detection of TRIMCpyfromMacaca fascicularisgenomic DNA from hairs follicle

本研究比较了用毛发和血液中DNA进行TRIMCyp的PCR扩增效果，其检测结果相同，表明从1根～2根毛发中提取基因组DNA进行PCR检测结果可信，可用于调查TRIMCyp嵌合基因型猕猴在中国的分布。该方法减轻了采样过程对猴体的刺激，同时也提高了采样的效率。但与血液中提取的基因组DNA样品相比，毛发样品在检测中有较高的非特异性条带产生，可能与毛发样品中基因拷贝数较少有关。此外，微量的毛发样品不适用于转录剪切异构体分析的RT-PCR检测。可先应用毛发PCR法进行被检动物的初筛，然后再从选定的个体的血细胞中提取DNA或RNA做进一步分析。

图4 食蟹猴白细胞DNA样品PCR检测TRIMCyp突变结果Fig.4 PCR detection of TRIMCpyfromMacaca fascicularisgenomic DNA from white blood cells

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