羊痘病毒3个结构蛋白的克隆与抗原性分析

颜新敏，吴国华，李 健，朱海霞，朱彩珠，张 强

(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学开放实验室，甘肃兰州730046)

羊痘是由羊痘病毒(Capripoxvirus，CPV)引起的以羊的体温升高，全身性丘疹或结节，肺部病变为主要特征的动物传染病。该病是一种非常古老的动物疫病，早在公元200年兽医文献就有详细的描述，目前在北非、中东、欧洲、亚洲及澳大利亚有流行[1]。我国的西北、西南、中南、华东、东北和华北地区均有羊痘疫情的报道，其中西北是我国羊痘疫情最集中的地区[2-5]。

在CPV的诊断研究中，由于CPV与羊口疮病毒存在共同抗原，用一般的血清学方法难以将两种病原区别。因此用CPV特异性重组抗原建立CPV抗原和抗体的ELISA诊断方法成为国内外研究的重点。国内外用于预防CPV的疫苗主要是弱毒疫苗，这种疫苗虽然有很好的免疫原性，但存在安全隐患。不论是从诊断试剂的研发还是新型疫苗的研制，对抗原的筛选是基础。目前国内外对羊CPV抗原的研究主要集中在p32囊膜蛋白上；对其它蛋白的研究很少，本研究克隆和表达了CPV的3个开放阅读框(ORF57、ORF95和ORF117)，对其抗原性进行了初步探究，丰富了CPV蛋白的研究。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株及主要试剂 山羊痘弱毒疫苗由中牧有限公司兰州生物药厂生产，DH5α感受态细胞、pMD18-T载体、BamHⅠ酶、EcoRⅠ酶、T4连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；pGEX4T-1载体、BL21(DE3)Plyss感受态细胞由本实验室保存。检测血清为自然感染羊痘的血清，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 引物设计 参照GenBank羊痘病毒相应序列设计引物，引物序列见表1。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

表1 序列引物Table 1 Primers of targets fragment amplified

1.3 病毒DNA的提取和目的片段的扩增 山羊痘冻干弱毒疫苗用0.05 M的PBS稀释后离心收集上清，用病毒DNA提取试剂盒提取病毒核酸，以提取的病毒DNA为模板，用ExTaq酶进行扩增。ORF57、ORF95和ORF117的退火温度分别为52℃、50℃和45℃。

1.4 克隆载体的构建、测序分析 将纯化的目的片段与pMD18-T载体连接后转化DH5α感受态细胞，鉴定正确的阳性克隆分别命名为pMD-57、pMD-95和pMD-117，送至宝生物工程(大连)有限公司测序，测得序列翻译成蛋白质与GenBank中登录的序列比对。

1.5 重组表达载体的构建 用BamHⅠ和EcoRⅠ将pGEX4T-1和pMD-57、pMD-95和pMD-117分别酶切，用常规方法克隆重组表达载体，将鉴定正确的阳性克隆转化到BL21(DE3)Plyss感受态细胞中，阳性克隆命名为pGEX-57、pGEX-95和pGEX-117。

1.6 重组表达菌的诱导表达，SDS-PAGE及western blot分析 3个重组表达菌按常规方法进行诱导表达、SDS-PAGE电泳和western blot分析。Western bot分析的一抗和二抗分别是1∶100稀释的山羊痘血清和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔血清。

2 结果与讨论

2.1 PCR扩增与蛋白质序列分析 将ORF57、ORF95和ORF117的PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳分析，能观察到约1 000 bp条带，2个约500 bp的目的条带，与预期相符(图1)。将3个PCR产物分别克隆到pMD18-T载体中，经PCR和双酶切鉴定插入正确。与GenBank上登录的山羊痘病毒、绵羊痘病毒和皮肤疙瘩病病毒相应序列比对，与ORF57和ORF95的同源性均为100%，与ORF117的同源性达到99%。

2.2 重组表达载体的构建与诱导表达 将原核重组表达载体pGEX-57、pGEX-95和pGEX-117分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定,结果与预期大小一致，表明重组表达载体构建成功。经诱导表达后取重组菌裂解物进行SDS-PAGE，结果表明ORF57、ORF95和ORF117均在原核细胞中得到有效表达，分子量大小分别为67 ku、43.8 ku和42.5 ku(图2)。

2.3 重组表达菌的western blot分析 Western blot分析显示，山羊痘感染血清能与ORF57和ORF95反应，但不能识别ORF117(图3)。

本实验克隆了CPV的3个结构蛋白，其中ORF57和ORF95编码病毒的核心蛋白在病毒的组装过程中发挥重要的功能[7-8]。Timothy等研究表明ORF57和ORF95能与羊痘血清发生特异反应[9]。ORF117与痘苗病毒的A27L同源，该蛋白位于EEV病毒粒子表面[10]。Christiana等研究表明A27L能刺激机体产生中和抗体，对病毒的攻击具有部分保护作用[11]。本实验表明ORF57和ORF95编码蛋白能与羊痘感染血清发生特异性反应。一般来说，中和抗原位于病毒或细菌的表面，而我们所克隆的ORF57和ORF95是病毒的核心蛋白。Mallon等在研究ORF95的痘苗病毒的同源蛋白时认为当病毒感染细胞裂解后，痘苗病毒释放出蛋白，该蛋白与B细胞作用，产生中和抗体[12]。而ORF57编码的核心蛋白能使机体产生抗体的原因还需要进一步研究。本研究为重组诊断抗原的筛选和亚单位疫苗的研制奠定了基础。

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