瘦素受体 3057位基因多态性与 2型糖尿病及血脂的关系

陈利荣, 贾艳梅 (山西医科大学汾阳学院教务处, 汾阳 0300; 山西医科大学汾阳学院医学检验系; 通讯作者,E-mail:clr98@63.com)

瘦素(leptin)是肥胖基因编码的一种脂源性激素,瘦素受体(leptin receptor,LR)是 leptin的高亲和力受体,是脂肪细胞分泌的具有保持机体能量平衡的激素,它们结合后方能发挥调节能量代谢和体脂平衡的作用。LR基因又被称为糖尿病基因[1],于1995年被定位克隆[2]。人类 LR基因位于 1p31,长约 5.1 kb,含 20个外显子,19个内含子,编码 1 165个氨基酸[3,4]。目前已在其 20个外显子中发现了19种基因多态性,但关于该基因变异与人类糖尿病等的关系报道不一[5,6]。本实验选择 LR基因外显子 20,检测 +3057位核苷酸 G→A多态性,探讨该变异与 2型糖尿病及血脂的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究以 130例山西省吕梁地区汉族人为研究对象,其中 DM组 68例(男 35例,女33例),年龄 36-70岁,根据 1999年 WHO糖尿病诊断标准,均为医院就诊者,排除家族性高脂血症患者;正常对照组 62例(男 29例,女 33例),年龄32-64岁。均为门诊健康体检者,无其他疾病。DM组与正常对照组在性别和年龄上均无显著差异。

1.2 研究方法

1.2.1 临床检测 ①空腹血糖:采用美国台欣血糖仪测定。②血脂的测定:总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)采用酶法测定;高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)采用直接测定法;低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)采用免疫透射比浊法。以上指标均在同一台日本 OLYMPUSAU640全自动生化分析仪进行。

1.2.2 基因组 DNA的提取 用常规酚/氯仿法提取外周血基因组 DNA,应用 751 GD紫外可见分光光度计检测基因组 DNA的浓度和纯度。

1.2.3 目的 DNA片段的 PCR扩增 PCR反应体系为 25μl,其引物如下:上游引物:5′-ACT GTG GTC TCTCTACTT TC-3′;下游引物 :5′-CCA TGA GCT ATT AGA GAA AGA ATCCGT CAA-3′(大连宝生物公司合成)。用德国 SENSO产 LABCYCLER MOTOR型梯度 PCR仪进行扩增,经 3%琼脂糖凝胶电泳,EB染色检测 PCR基因产物。

1.2.4 PCR产物的酶切及基因分型 ①酶切反应在 12μl体系中进行,内切酶 Bsa HⅠ 65℃水浴消化 4 h。②聚丙烯酰胺凝胶电泳分型:按常规方法制备 8%中性聚丙烯酰胺凝胶,在室温下,180 V恒压,电泳5 h,银染,紫外凝胶成像系统成像存档,分析电泳结果。

1.3 统计学分析 电泳后从凝胶上直接判读个体的基因型,计算各等位基因频率及基因型频率。等位基因变异频率比较用 χ2检验,组间比较采取 χ2检验,计量资料比较采取 F检验及 q检验。

2 结果

2.1 PCR产物的检测及酶切结果 所设计引物摸索了适宜的 PCR条件,有较好的扩增效果。不同个体 LR的扩增片段大小均呈现一致的 276 bp带型,没有非特异性扩增带,可以直接进行 RFLP电泳分析,结果见图 1。

图1 LR基因 PCR产物电泳结果(3%琼脂糖凝胶)Fig 1 PCR product of LR gene(3%agarose gel)

PCR产物经 Bsa HⅠ酶切消化及聚丙烯酰胺凝胶(PCR-RF-SSCP)后,呈现多态性。依据条带数和位置判定为 3种基因型,分别是 AA基因型(75 bp,201 bp),AG基因型(75 bp,173 bp,201 bp)和 GG基因型(28 bp,75 bp,173 bp),结果见图 2。

图2 LR基因外显子20 PCR-RF-SSCP电泳检测结果Fig 2 Electrophoresis results of LR gene by PCR-RF-SSCP

2.2 LR基因的 PCR-RF-SSCP各基因和基因型的分布与频率 LR基因在 +3057位核苷酸 G→A变异,总的基因变异频率(G→A)为 79.27%,DM组的变异频率为 86.76%,正常对照组的变异频率为71.77%,DM组 A等位基因频率显著高于正常对照组(χ2=6.19,P=0.016)。DM组中 AA型的频率显著高于正常对照组(76.47%vs 50.00%,χ2=7.33,P=0.026),而 GA型的频率低于正常对照组(20.60%vs43.55%),结果见表1。

表1 LR基因PCR-RF-SSCP基因型频率和基因频率在不同组别中的分布Tab 1 Gene frequency and genotype frequency o f LR in different groups

2.3 LR基因多态性与 2型糖尿病及血脂的关系根据 LR基因的 PCR-RF-SSCP结果呈现出的多态,将研究对象分为 3个组:AA型组、GA型组、GG型组。AA基因型组甘油三酯高于 GA型组,高于 GG型(P＜0.05),而高密度脂蛋白低于 GA型组,低于GG型(P＜0.05),组间比较结果见表2。

表2 LR 3057位基因多态性与血脂的关系 (±s)Tab 2 Relationship o f LR 3057 gene polymorphisms with the b lood lipid level (±s)

表2 LR 3057位基因多态性与血脂的关系 (±s)Tab 2 Relationship o f LR 3057 gene polymorphisms with the b lood lipid level (±s)

与 AA型比较,*P＜0.05,**P＜0.01

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3 讨论

LR是 leptin的高亲和力受体,是 leptin发挥作用的重要中介物质。自 1994年 LR基因被定位克隆以来,瘦素及其受体与肥胖及其相关疾病如高血压、糖尿病、脂质代谢紊乱等的关系成为近年来又一研究热点。目前研究已经证实了 LR基因多种突变和多个多态性位点[7-10]。Matsuoka等[6]应用 PCR技术对日本肥胖病人 LR基因 2-20外显子进行扩增测序分析发现 4种核苷酸顺序变异,其变异频率分别为 79%,91%,100%,85%,并研究了其变异与肥胖的关系,但未见相关性。Chen等[1]在美国人中发现瘦素受体基因突变,其中 3种氨基酸改变,3种静息突变,还发现 4种内含子序列变异。鲁红云等[11]发现 LR第 +3057位核苷酸基因多态性可能通过影响机体局部体脂分布和脂质代谢、调节胰岛素敏感性等参与 2型糖尿病的发生。Behn等[12]发现人该基因变异与早发性(≤45岁)糖尿病有关。Tumoi等[5]通过杂合双向分析发现,该基因变异不能解释肥胖患者的胰岛素抵抗,但参与葡萄糖不耐受的发生。

本结果表明,山西吕梁地区汉族人存在 LR基因变异,其中 20外显子 +3057位核苷酸由鸟嘌呤(G)→腺嘌呤(A),变异频率为 79.27%,DM组和正常对照组 +3057位基因变异频率比较有显著差异(86.76%vs71.77%,P＜0.05)。DM患者中 AA型频率显著高于对照组,而 GA型频率低于对照组,病例组中 GG型频率只有 2.94%。说明随着等位基因 A的增加,患 2型糖尿病的危险性逐渐增加,提示 LR的 A等位基因可能是吕梁地区人群 2型糖尿病的遗传易感标记。另外本研究还发现 AA基因型组甘油三酯高于 GA型组,高于 GG型组(P＜0.05),而高密度脂蛋白低于 GA型组,低于 GG型组(P＜0.05)。提示,其基因变异可能主要影响机体的体脂分布和脂肪代谢,并通过调节胰岛素的敏感性来参与 2型糖尿病的发生。本次研究结果与国内鲁红云等[11]、唐晓君等[13]、国外 Matsuoka等[6]的报道基本一致。

瘦素及 LR与多种正常生理功能的维持有着密切的关系。但由于人种和民族的不同、实验技术和实验方法等方面的限制,且由于瘦素受体基因结构复杂,变异多样,对其与肥胖、2型糖尿病、脂质代谢的关系,以及表达调控及信号传导机制,对瘦素受体内含子改变及其与外显子的联系,尚有待于更深入的研究。对瘦素作用的详细机制以及与各种相关代谢途径甚至癌症发生关系的研究,LR的其他异型体与瘦素有何关系,尤其是在 LR功能异常时机体的代偿反应如何,可借助基因工程手段,如建立 LR其他异型体基因修饰小鼠模型进行研究,弄清这些问题,有助于诊断和治疗上述疾病,可为今后的基因治疗提供新的思路。

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