高效液相色谱法测定活血降酶散中的丹参酮ⅡA

刘光斌李怀彪毛和平

（1甘肃省酒钢医院，甘肃 嘉峪关 735100；2嘉峪关市药品检验所）

高效液相色谱法测定活血降酶散中的丹参酮ⅡA

刘光斌1李怀彪2毛和平1

（1甘肃省酒钢医院，甘肃 嘉峪关 735100；2嘉峪关市药品检验所）

【摘要】目的：采用高效液相色谱法测定组方中主药丹参所含药理活性成分丹参酮ⅡA的含量。方法：色谱柱：C18（DaisoSp-120-5-ODS-AP 4.6×250 mm 5 μm）；流动相：甲醇-水（80∶20）；检测波长为270 nm，柱温：30℃；流速：1.0 mL/min。结果：丹参酮ⅡA进样量在0.026 67～0.213 4 μg范围内线性良好（r=0.999 9），平均回收率为98.94%，RSD为1.27%。结论：所用方法准确、简便、易行，可用于活血降酶散的质量控制。

【关键词】活血降酶散；高效液相色谱法；丹参酮ⅡA

活血降酶散是由丹参、五味子、红花等中药组成的临床经验方，经过多年临床疗效观察，对肝炎（包括甲肝、乙肝、丙肝）和黄疸型肝炎瘀血引起的血清转氨酶升高者有非常显著的降酶作用；同时能保护肝细胞损伤，促进肝细胞再生。为确保该制剂的疗效及有效控制制剂质量，我们采用高效液相色谱法（HPLC）对组方中主药丹参所含药理活性成分丹参酮ⅡA（C19H18O3）的含量进行了测定，报告如下。

1 试验仪器与材料

仪器：BisepTM-1100型高效液相色谱（美国通微公司）；LC-10AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）；U-3900H紫外—可见分光光度计（HITACHI日立公司）；HS2060A超声波清洗器。

试剂：含量测定用甲醇为色谱纯，水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

样品：活血降酶散3个批次（20090705，20090820，2009 0910）均由酒钢医院提供；丹参酮ⅡA对照品（中国药品生物制品检定所，批号110766-200314，供含量测定用）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：C18（DaisoSp-120-5-ODS-AP 4.6×250 mm 5 μm）；流动相：甲醇-水（80∶20）；检测波长为270 nm，柱温：30℃；流速：1.0 mL/min。理论塔板数按丹参酮ⅡA（C19H18O3）峰计算不低于2 000，分离度大于1.5。

2.2 对照品溶液的制备

取丹参酮ⅡA照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含10.668 μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取同一批次（20090820）样品粉末0.9 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照试验

按处方取除丹参外的各味药材混合粉末0.6 g,按供试品溶液的制备方法，同法制得阴性供试品溶液。依法测定。结果阴性供试品在与丹参酮ⅡA对应的保留时间处无干扰，结果见图1。

2.5 线性关系的考察

取丹参酮对照品溶液（每1mL含10.668 μg），分别精密吸取2.5、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积均值为纵坐标，求得回归方程：Y=6×106X－1 432.4，r=0.999 9。结果表明丹参酮ⅡA对照品在0.026 67～0.213 4 μg范围内线性良好。

2.6 进样精密度试验

精密吸取丹参酮ⅡA对照品5 μL，连续进样6次，测定丹参酮ⅡA峰面积，结果RSD为0.72%，符合文献[3]低于1.5%的要求。

2.7 重复性试验

取同一批次（20090820）样品粉末6份,每份0.9 g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备,依法测定,结果供试品中丹参酮ⅡA平均含量为0.31 mg/g，RSD为0.32%。表明本方法重复性较好。

图1 HPLC色谱图

2.8 回收率试验

取同一批次（20090820）样品粉末6份，每份0.90 g，精密称定，分别精密加入丹参酮ⅡA对照品溶液（10.668 μg/ml）25 mL，按供试品溶液的制备方法制备，测定，结果平均回收率为98.94%，RSD为1.27%。结果见表1。

结果表明，本方法测定回收率较好。

表1 回收率试验

2.9 稳定性试验

取同一供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、10小时进样，测得峰面积值的RSD为0.59%，结果见表2。

结果表明供试品溶液在10小时内基本稳定。

表2 稳定性试验

2.10 样品测定

按上述方法测定三批样品，，三批样品丹参酮ⅡA含量平均值0.304 3 mg/g。结果见表3。

表3 样品测定

2.11 含量限度的制定

按照表6三批样品测定结果的平均值0.304 3 mg/g，下浮至80%计算，暂定本品每1 g含丹参按丹参酮ⅡA （C19H18O3）计算，不得少于0.24 mg。

3 讨论

3.1 波长的选择

通过对丹参酮ⅡA对照品溶液在200～400 nm处进行紫外光谱扫描检测显示，丹参酮ⅡA在270 nm处有最大吸收，与文献[2]采用的波长相同。

3.2 提取方法的确定与考察

3.2.1 提取方式的确定 取同一批次（20090820）供试品粉末0.9 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，分别超声处理（功率200 W，频率40 kHz）及与加热回流30 min，放冷，依法测定。结果显示，采用超声处理与加热回流含量结果基本一致，故采用超声处理方式提取，以简化操作。结果见表4。

表4 提取方式的考察

3.2.2 提取溶剂的比较取同一批次（20090820）供试品粉末0.9g，精密称定，置具塞三角瓶中，分别精密加入甲醇与乙醇各25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）30分钟，依法测定。结果显示，采用甲醇提取测定含量略高，故采用甲醇作提取溶剂为宜。结果见表5。

表5 提取溶剂的比较

3.2.3 提取溶剂量的考察取同一批次（20090820）供试品粉末0.9 g，精密称定，置具塞三角瓶中，分别精密加入甲醇25 mL、50 mL、75 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）30分钟，依法测定。结果显示，提取溶剂量为25 mL时测得含量较高，故将提取溶剂量定为25 mL。结果见表6。

3.2.4 提取时间的考察取同一批次（20090820）供试品粉末0.9 g，精密称定，置具塞三角瓶中，各精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，分别超声处理（功率200W，频率40 kHz）15 min、30 min、45 min，依法测定。结果显示，超声提取30 min时供试品中丹参酮ⅡA含量较高，故将提取时间定为30 min。结果见表7。

表6 提取溶剂量的考察

3.3 耐用性试验

3.3.1 不同色谱柱的考察分别用DaisoSp-120-5-ODS-AP C18（4.6×250 mm，5 μm）与 AT.LICHROM C18（4.6×150 mm，5 μm）色谱柱，采用BisepTM-1100型高效液相色谱仪，测定同一批次（20090820）供试品中丹参酮ⅡA含量，二者RSD为0.58%。结果显示，不同色谱柱对测定结果无影响。结果见表8。

表7 提取时间的考察

3.3.2 不同仪器的考察采用DaisoSp-120-5-ODS-AP C18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱，分别在BisepTM-1100型与LC-10AD型高效液相色谱仪上，测定同一批次（20090820）供试品的含量，二者RSD为0.7%。结果显示，不同仪器对测定结果无影响。结果见表9。

表8 不同色谱柱对含量测定的影响

表9 不同仪器对含量测定的影响

参考文献：

[1]周福成.2010年版《中国药典》编制工作报告[J].中国药品标准，2010,9（1）：9.

[2]国家药典委员会《.中国药典》2005年版,一部[S].2005：58，附录6,附录18,附录31，附录33,附录114.

[3]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范2005年版[M].北京：中国医药科技出版社,2005：84.

作者简介：刘光斌，男，副主任药师。研究方向：制剂研究。E-mail：jgyylgb@sina.com

Determination of TanshinoneⅡA in Huoxuejiangmei Powder by HPLC

Liu Guangbin1,Li Huaibiao2,Mao Hepin1（1 Jiugang Hospital of Gansu，Jiayuguan 735100,China；2 Jiayuguan Institute for Drug Control）

ABSTRACTObjective:To develop a HPLC method to determine the contents of TanshinoneⅡA in Radix et RhizomaSalviaeMiltiorrhizaein HuoxuejiangmeiPowder.Methods:Thedetermination wasperformed ona DaisoSp-120-5-ODS-AP（4.6×250 mm 5 μm）.The column temperature was set at 30℃.The mobile phase consisted of methanol-water(80∶20).The UV detection wavelength was 270 nm and the flow rate was 1.0 mL/min.Results:The linear range of TanshinoneⅡA was within 0.026 67～0.213 4 μg with a correlation coefficient of 0.999 9.The average recovery was 98.94%andRSDwas 1.27%.Conclusion:The method is accurate,simple,feasible,and can be used effectively for the quality control of Huoxuejiangmei Powder．

KEY WORDSHuoxuejiangmei Powder;HPLC;TanshinoneⅡA