不同产地细辛中有效成分与马兜铃酸Ⅰ含量差异比较

刘雅婧李春杰周英亮张连学

（1吉林大学植物科学学院，吉林 长春 130118；2吉林省合龙市科技局，吉林 延吉 133500）

不同产地细辛中有效成分与马兜铃酸Ⅰ含量差异比较

刘雅婧1李春杰1周英亮2张连学1

（1吉林大学植物科学学院，吉林 长春 130118；2吉林省合龙市科技局，吉林 延吉 133500）

【摘要】目的：测定不同产地细辛及其不同入药部位中的肾毒性成分和有效成分的含量，优选出肾毒性成分含量低、有效成分含量高的细辛药材品种及产地。方法：HPLC法测定马兜铃酸Ⅰ及细辛脂素的含量；GC法测定甲基丁香酚含量。结果：不同产地细辛中，马兜铃酸Ⅰ含量以陕西宁强（华细辛）地下部分最高，为0.452 8 mg/g，以吉林通化（北细辛）地上部分最低，为0.008 3 mg/g；甲基丁香酚含量以吉林合龙（汉城细辛）地下部分含量最高，为1.35%，细辛脂素含量以吉林合龙（汉城细辛）地下部分含量最高，为3.92 mg/g。结论：不同产地细辛马兜铃酸Ⅰ、细辛脂素、甲基丁香酚含量差异较大。

【关键词】细辛；马兜铃酸Ⅰ；甲基丁香酚；细辛脂素

细辛（Herbar Asarum）为马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag，汉城细辛Nakai或华细辛Asarun sieboldii Miq的根及根茎[1]。具有祛风散寒、通窍止痛、温肺化饮的功效。

细辛的化学成分包括甲基丁香酚、黄樟醚、榄香素、桉油精、细辛醚、细辛脂素、马兜铃酸Ⅰ等。其中，甲基丁香酚为主要有效成分。细辛脂素是存在于细辛中的木脂素类化合物，具有抗病毒和抗结核杆菌的作用[2]。据文献报道[3]，细辛中的马兜铃酸Ⅰ有致癌及肾损害作用，“马兜铃酸肾病”曾在国际上引起了轩然大波，对我国中药产业产生了极不良影响。

另外，关于细辛的入药部位，从古至今多有变更。细辛在古代据《神农本草经》，以根入药。直至近代采用全草入药，2005版药典又将其改回根及根茎入药，故合理的入药部位有待探究。

现有报道多是集中于单独对细辛中的马兜铃酸的含量测定，而没有综合其有效成分对其进行完整的评价。为了筛选好的细辛药材产地、优选优质品种，探究其合理入药部位，本文以马兜铃酸Ⅰ、甲基丁香酚、细辛脂素三种成分为指标，采用HPLC、GC手段，对不同产地、不同品种、不同入药部位的细辛做了完整的含量差异分析，从而优选出肾毒性成分低、有效成分高的细辛药材产地，以期为临床合理应用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 实验材料

陕西宁强（华细辛），2006年8月采于陕西省宁强县；辽宁清原（北细辛），2006年8月采于辽宁省清原县；吉林通化（北细辛），2006年8月采于吉林省通化县；吉林左家（北细辛），2006年8月采于吉林省左家镇；吉林合龙（汉城细辛），2007年8月采于吉林省合龙县。

以上品种均经过吉林农业大学中药材学院张连学教授鉴定。

1.2 药品

马兜铃酸Ⅰ对照品（中国药品生物制品检定所，批号110746-200305）；细辛脂素（上海博蕴生物公司，批号110785-200307）；甲基丁香酚（中国药品生物制品检定所，批号111642-200301）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司，批号20050623）；乙腈（色谱纯，美国 Fisher公司，批号20021231）。

1.3 仪器

LC-lOAvp高效液相色谱仪(日本岛津)；GC-14A气相色谱仪(日本岛津)。

2 方法与结果

2.1 HPLC法测定药材中马兜铃酸Ⅰ的含量

2.1.1 色谱条件[3，5]C18色谱柱 (200 mm×4.6 mm,5 μm)（大连江申）；流动相：甲醇∶1%冰醋酸（75∶25）；检测波长：315 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃（波长的选择：根据文献选择了多个波长做了对比，在相同条件下：马兜铃酸Ⅰ在315 nm处的吸收强度最大，峰型最好）。

2.1.2 对照品溶液的制备精密称取马兜铃酸Ⅰ对照品4.6 mg，用无水乙醇溶解，定容于5 mL容量瓶中。精密吸取1 mL至10 mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，制得浓度为0.092 mg/mL的对照品储备液。

2.1.3 线性关系考察取对照品溶液，用无水乙醇配成浓度分别为 9.2 μg/mL、4.6 μg/mL、2.3 μg/mL、1.15 μg/mL、0.575 μg/mL、0.287 5 μg/mL的系列溶液。取五种浓度的对照品溶液分别依次进样20 μL，每份进样3针，记录峰面积，以马兜铃酸Ⅰ量（μg）为横坐标，平均峰面积为纵坐标，进行线性回归。得回归方程为Y=26 098X+18 912，r=0.999 9。马兜铃酸Ⅰ在9.2 μg/mL～0.287 5 μg/mL范围内浓度与其峰面积呈良好线性关系。

2.1.4 供试品溶液的制备[3，6]精密称取细辛药材粉末（60目）1g，置25 mL容量瓶中，加入甲醇-10%甲酸水(4∶1)约20mL，浸泡1 h后，超声提取三次，每次15 min，定容至25 mL，过0.45 μm微孔滤膜，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液。

2.1.5 精密度实验精密吸取浓度为2.3 μg/mL的对照品溶液20 μL，重复进样5次，计算RSD值为0.42%。结果表明精密度良好。

2.1.6 稳定性实验取细辛药材陕西宁强（华细辛）地上部分粉末1份，精密称定1 g，依2.1.4项下的方法制成供试品溶液，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h分别进样20 μL，记录峰面积值。计算RSD值为0.74%。结果表明该法稳定性良好。

2.1.7 重复性实验取细辛药材陕西宁强（华细辛）地上部分粉末5份，各精密称定1 g，依2.1.4项下的方法法制成供试品溶液。记录峰面积值。计算RSD值为1.86%。结果表明该法有良好的重复性。

2.1.8 加样回收率实验取已知含量的药材陕西宁强（华细辛）地上部分粉末5份，各精密称定1 g，分别精密添加一定量的对照品，按供试品溶液制备方法进行提取，含量测定。测得马兜铃酸I的平均回收率为98.27%，RSD值为1.16%。结果表明回收率符合含量测定要求。结果见表1。

2.1.9 样品含量测定取不同产地细辛的药材粉末，依法制成供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL按2.1.1项下色谱条件测定，结果见表2。色谱图见图1、图2。

表1 加样回收率实验结果(%)

表2 不同产地细辛马兜铃酸Ⅰ含量测定结果(mg/g)

从表2中可以看出，各产地地下部分与地上部分相比马兜铃酸Ⅰ含量达到0.01的显著水平。相关性分析得出r= 0.981，r＞r0.01。地上部分与地下部分的马兜铃酸Ⅰ含量的线性相关关系有极显著意义。

2.2 HPLC法测定药材中细辛脂素的含量

2.2.1 色谱条件[2]C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)(大连江申)；流动相：乙腈与水进行梯度洗脱，乙腈在15 min内由15%～100%；检测波长：287 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃。

图1 马兜铃酸Ⅰ标准品HPLC色谱图

图2 细辛样品马兜铃酸ⅠHPLC色谱图

2.2.2 对照品溶液的制备精密称取细辛脂素对照品1.5 mg，用乙酸乙酯溶解，定容于5 mL容量瓶中。制得浓度为0.30 mg/mL的对照品储备液。

2.2.3 线性关系的考察取对照品溶液，用乙酸乙酯配成浓度分别为0.6 μg/mL、1.2 μg/mL、2.4 μg/mL、12 μg/mL、60 μg/mL、300 μg/mL的系列溶液。取六种浓度的对照品溶液分别依次进样20 μL，每份进样3针，记录峰面积，以细辛脂素为横坐标，平均峰面积为纵坐标，进行线性回归。得回归方程为Y=1 546 200X+56 235，r=0.999 9。细辛脂素在0.012 μg～6.0 μg范围内与其峰面积呈良好线性关系。

2.2.4 供试品溶液的制备[2]精密称取细辛药材粉末（60目）1g，乙酸乙酯索氏提取器加热回流提取120 min，乙酸乙酯定容至50 mL。过0.45 μm微孔滤膜，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液。

2.2.5 精密度实验精密吸取浓度为0.6 μg/mL的对照品溶液20 μL，重复进样5次，计算RSD值为3.0%。结果表明该法精密度良好。

2.2.6 稳定性实验 取细辛药材陕西宁强（华细辛）粉末1份，精密称定1g，依2.2.4项下的方法制成供试品溶液，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h分别进样20 μL，记录峰面积值。计算RSD值为1.24%。结果表明该法稳定性良好。

2.2.7 重复性实验取细辛药材陕西宁强（华细辛）粉末5份，各精密称定1g，依2.2.4项下的方法制成供试品溶液。记录峰面积值。计算RSD值为1.65%。结果表明该法有良好的重复性。

2.2.8 加样回收率实验取已知含量的药材吉林左家（北细辛）粉末5份，各精密称定1g，分别精密添加一定量的对照品，按供试品溶液制备方法进行提取，含量测定。测得细辛脂素平均回收率为97.81%，RSD值为2.12%。结果表明回收率符合含量测定要求。结果见表3。

2.2.9 样品含量测定取不同产地细辛的药材粉末，依法制成供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL按2.2.1项下色谱条件测定，结果见表4。色谱图见图3、图4。

表3 加样回收率实验结果(%)

从表2中可以看出，各产地地下部分与地上部分相比细辛脂素含量达到0.01的显著水平。相关性分析得出r= 0.909，r＞r0.01。地上部分与地下部分的细辛脂素的含量线性相关关系有极显著意义。

2.3 GC测定药材中甲基丁香酚的含量

2.3.1 色谱条件[4]色谱柱：DB-1石英毛细管柱；柱长：30 m；内径：0.25 mm；柱温：开始80℃保持3 min，以10℃/min的速率升至240℃；气化室温度：280℃；检测器温度：280℃；载气：氮气；检测器：FID；进样量：1 μL。

表4 不同产地细辛细辛脂素含量测定结果(mg/g)

图3 细辛脂素标准品HPLC色谱图

2.3.2 挥发油提取挥发油提取按《中华人民共和国药典》2005年版一部附录XD挥发油测定法项下规定的方法进行。以无水硫酸钠干燥。

2.3.3 对照品溶液的制备精密量取甲基丁香酚对照品20μL[4]，置于1mL容量瓶中，环己烷定容至刻度。制得浓度为20 μL/mL的对照品储备液。

2.3.4 供试品溶液制备[4]将按照2.3.2项下规定方法提取的细辛挥发油，置于10 mL容量瓶中，环己烷定容至刻度，过0.45 μm微孔滤膜，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液。

2.3.5 线性关系的考察取对照品溶液配成浓度分别为0.012 5 μL/mL、0.125 μL/mL、0.25 μL/mL、0.5 μL/mL、10 μL/mL、20 μL/mL的系列溶液。取六种浓度的对照品溶液分别依次进样1μL，每份进样3针，记录峰面积，以甲基丁香酚的量为横坐标，平均峰面积为纵坐标，进行线性回归。得回归方程为Y=225 655X+98 487，r=0.999 8。甲基丁香酚浓度在0.012 5～20 μL/mL范围内呈良好线性关系。

2.3.6 精密度实验精密吸取浓度为0.5 μL/mL的对照品溶液，重复进样5次，记录峰面积，计算RSD值，RSD值为1.41%。结果表明该法精密度良好。

2.3.7 稳定性实验取吉林合龙(汉城细辛)地下部分样品溶液，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h分别进样，记录峰面积值。计算RSD值为0.25%。结果表明该法稳定性良好。

2.3.8 重复性实验取细辛药材吉林合龙(汉城细辛)5份，分别制成样品溶液，进样分析，测定甲基丁香酚峰面积，计算RSD值为1.51%。结果表明该法重复性良好。

2.3.9 加样回收率实验取已知含量的药材吉林通化(北细辛)5份，制成供试品，分别精密添加一定浓度的标准品，进行含量测定，测得甲基丁香酚的平均回收率为97.35%，RSD值为1.16%。结果见表5。

2.3.10 样品含量测定将依法制得的各个产地和各个部位的细辛的供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进行测定。结果见表6。色谱图见图5、图6。

图4 细辛样品细辛脂素HPLC色谱图

表5 加样回收率实验结果(%)

表6 不同产地细辛甲基丁香酚含量测定结果(%)

从表3中可以看出，除陕西宁强(华细辛)各产地地下部分与地上部分相比甲基丁香酚含量达到0.01的显著水平。相关性分析得出r=0.809，r＞r0.01。地上部分与地下部分的甲基丁香酚的含量线性相关关系有极显著意义。说明地下部分的甲基丁香酚含量明显高于地上部分。

3 结果分析与讨论

图5 甲基丁香酚标准品GC色谱图

图6 细辛样品甲基丁香酚GC色谱图

3.1 从不同品种进行比较分析：因吉林通化为北细辛的主要产区，故将其作为北细辛品种的代表与其他两个品种进行比较。结果表明：马兜铃酸Ⅰ含量最高的为华细辛，最低的为北细辛；细辛脂素含量最高的为汉城细辛，最低的为华细辛；甲基丁香酚含量最高的为汉城细辛，最低的为华细辛。

3.2 从细辛的不同入药部位来看，有效成分甲基丁香酚和细辛脂素的含量为地下部分高于地上部分。由此可以看出，古代采用细辛根入药以及2005年药典将细辛由全草入药改回根及根茎入药是合理的。但是，地下部分所含的肾毒性成分也很高，此问题期望通过有效的炮制手段来加以解决。

3.3 因三种成分的地上部分与地下部分含量均具有相关性且差异显著，在进行育种工作时，可以只取细辛的地上部分进行有效成分与有毒成分的测定，同时保留其地下部分不被破坏，进一步作繁殖材料，通过系统选育，有望优选出有害成分马兜铃酸含量低而细辛脂素等有效成分含量高的品种。

参考文献：

[1]中华人民共和国药典委员会．中华人民共和国药典[M]．化学工业出版社，2005：159．

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[4]周长征，杨春澎，马长华.气相色谱法测定细辛挥发油中甲基丁香酚和黄樟醚的含量 [J].中国药学杂志,1999,34(12)：836-839.

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[6]韩娜，路金才，毕开顺，等．RP-HPLC法测定14种中药材中马兜铃酸的含量 [J]． 沈阳药科大学学报，2008,25(2)：115-118.

张连学，男，教授，博士生导师。主要研究方向：中药GAP规范化种植、中药质量评价及中药活性成分研究。通讯作者E-mail：zlxbooksea@163.com

基金项目：科技部长白山主要中药材育种与规范化生产关键技术研究。项目编号（2004DA507A17）

作者简介：刘雅婧，女，中药学硕士。研究方向：中药化学。

Determination of Effective Components and Aristolochic AcidⅠ in Asarum Herb from Different Habitats

Liu Yajing1,Zhang Chunhong1,Zhou Yingliang2,Zhang Lianxue1(1 College of Traditional Meteria Medica,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;2 HeLong Technology Situation,YanJi 133500)

ABSTRACTObjective:Determinning both components of harmful aristolochic acidⅠand effective elements of asarinin and methyleugenol in herba asari (Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag, Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai and Asarun sieboldii Miq),to optimize the herb origin and its native habitat with the herb being high components and low nephrotoxicity.Method:Aristolochic acidⅠand asarinin were determined by HPLC;methyleugenol was determined by GC.Results:Among these herba asari,the highest content of aristolochic acidⅠwas 0.452 8 mg/g that form NingQiang Shannxi root,the lowest content of it was 0.008 3 mg/g that from Tonghua Jilin root.The highest contents of methyleugenol was 1.35%that from Helong Jilin root and the highest contents of asarinin was 3.92 mg/g that from Helong Jilin root.Conclusion:There was evident different in the contents of aristolochic acidⅠ,asarinin,and methyleugenol in herba asari from different habitats.

KEY WORDSAsarum;Aristolochic acidⅠ;Asarinin;Methyleugenol