食用油中DNA提取方法的研究进展*

张海亮，吴亚君，陈银基，鞠兴荣，陈颖

1(中国检验检疫科学研究院，北京，100123) 2(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏南京，210003)

食用油中DNA提取方法的研究进展*

张海亮1，2，吴亚君1，陈银基2，鞠兴荣2，陈颖1

1(中国检验检疫科学研究院，北京，100123) 2(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏南京，210003)

利用基于DNA的分子生物学手段对食用油进行品种鉴定、掺假检测已经成为研究的热点，而其瓶颈就是DNA提取。DNA提取是分子生物学的基础技术，能否提取到高质量的DNA，是食用油研究的关键。文中从样品的前处理、裂解和分离、DNA富集和纯化3个方面分别介绍了几种常用的食用油中DNA提取方法，并对其研究进展进行了概述。

食品安全，食用油，DNA提取

近年来，随着食品安全事故的频发，食品安全越来越成为人们关注的焦点。食用油安全是食品安全的重要内容之一。食用油掺假掺杂不仅威胁着人们的身体健康，而且侵犯消费者利益，影响消费信心，不利于食用油产业的健康发展。运用分子生物学技术对食用油进行品种鉴定及掺假检测是新发展起来的一种检测方法，与传统方法的理化检测和仪器分析检测相比(如测定过氧化值、脂肪酸比例、色谱分析等)，具有检测灵敏度高、可靠性强、操作简单和省时省力等优点。

运用分子生物学技术对食用油进行品种鉴定及掺假检测，首要前提是从油脂中提取出适合PCR扩增的DNA。由于精炼食用油生产需经过高温及高压等处理，其中的DNA降解为大小不一的碎片，且含量极低，这给DNA提取造成了很大困难。因而DNA提取技术成为食用油PCR检测技术的瓶颈，是食用油检测成功与否的关键所在。

国际上研究人员一直在努力探索食用油中DNA的提取技术。例如Pauli等［1］从粗制大豆油中提取DNA，但这种方法并不适合精炼植物油。另外有很多关于从橄榄油中成功提取DNA的报道［2－5］，主要原因是初榨橄榄油不经过精炼，极大地避免DNA的破坏和损失。1997年Maja Hellebrand等［6］首次从精炼菜籽油中提取到菜籽DNA，并证明可用于物种鉴定。2010年Joana Costa等［7］利用改良的试剂盒法从精炼植物油中提取大豆DNA，这是国外第一次报道从精炼植物油中检测到大豆DNA。

国内也有学者建立了食用油中DNA提取的方法。覃文等［8］在2002年就对油脂中转基因成分的检测进行了初步研究，并对市售的食用油进行了DNA提取，利用PCR-GeneScan技术对其进行了检测，且检测到植物内源基因。2004年金红等［9］对大豆色拉油中DNA的提取方法进行优化，采用PCR检测出大豆的外源基因。徐伟丽等［10］通过试剂盒改良，建立了一种稳定有效、重复性好、操作简便的油脂中DNA提取方法。白立群等［11］利用冷冻干燥技术对含有DNA的水相进行浓缩，建立了一种油脂中DNA提取的新方法，可用于转基因检测。

国内外在食用油中DNA提取方面所考虑的技术要点主要包括:(1)样品的前处理;(2)裂解和分离;(3)DNA富集和纯化。本文将针对这3个技术环节对目前的食用油中DNA提取方法进行介绍。

1 样品前处理

由于食用油是一种高度加工和纯化的产品，为了尽可能多的从油脂中分离残留的DNA分子，合理地对样品进行萃取和浓缩是必要的。目前常用的前处理方法是乳化法和浓缩法。

1.1 乳化法

将油相与水相或有机相进行充分的乳化处理，使油脂中的DNA保留在水相中，是提取DNA的关键。Clarissa Consolandi等［12］将橄榄油与正己烷混合，充分乳化后离心，并用含有吐温的裂解液和蛋白酶K分别处理上清和沉淀，经孵育和离心后，各分离相用预冷的异丙醇沉淀DNA，并用体积分数70%冷乙醇清洗，最后将DNA溶解于水中。实验利用多重PCR对提取的DNA进行检测，结果显示该方法不仅效率高，而且成本低，样品量小，仅需2mL橄榄油，便可提取到50μL总量为1.35μg的DNA，比Wizard试剂盒的起始检测油量低50倍。Maria等［13］在此法的基础上进行改进，将CTAB裂解液和正己烷等体积混合，并在60℃条件下与橄榄油充分乳化，提取结果显示改良的乳化法显著优于CTAB法和正己烷法。

1.2 浓缩法

由于精炼油经过复杂的处理后DNA含量极少，因此如果能用适当的方法将含有DNA的大量水相进行浓缩，将大大提高后续的提取效果。白立群等［11］建立了一种有效的大豆精炼油DNA提取方法——冷冻干燥法。冷冻干燥法将食用油与水充分乳化，利用冷冻干燥技术将水分完全蒸发，再使用CTAB裂解液从沉淀中提取和分离DNA。采用该方法从5种市售一级大豆油中提取DNA，成功检测到大豆内源Lectin基因、外源CaMV35S启动子、NOS终止子。

2 裂解和分离

DNA提取中常用的裂解液主要有CTAB、SDS、异硫氰酸胍等，基本原理是通过裂解液裂解细胞并分离DNA，利用酚/三氯甲烷等有机溶剂除去蛋白质等杂质，并加入异丙醇或乙醇等沉淀DNA，最终用TE缓冲液或双蒸水溶解DNA。目前常用的裂解和分离方法适合于动植物及微生物中DNA的提取，因此根据食用油组成及理化性质的不同，需要对已有的方法进行改良。

2.1 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法

CTAB法被广泛的应用于植物叶子、种子、微生物以及加工食品中的DNA提取，是一种经典的DNA提取方法［14－15］。其基本原理是:CTAB是一种阳离子去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在低盐溶液中因溶解度的降低而沉淀，而在高盐溶液中可解离，从而使DNA与多糖等杂质分开，再用乙醇沉淀DNA 而除去 CTAB。自从 Murray等人［16－17］首次使用CTAB法成功的提取植物基因组DNA，CTAB发展迅速，不断得到改进，已经成为分子生物学中提取DNA 的最常用的方法之一［18－20］。

根据食用油的性质和特点，经改良后的CTAB法更加适合食用油DNA的提取。Innocenzo Muzzalupo［4］利用CTAB法从橄榄油中提取 DNA，添加了蛋白酶K，并向CTAB提取缓冲液中加入2%的巯基乙醇，不仅能使蛋白质充分变性，还能够保护DNA的完整性，使提取的DNA更适合进行RAPD-PCR扩增。Matteo Busconi［21］等通过提高 CTAB 的浓度，并使用三氯甲烷/辛醇代替三氯甲烷/异戊醇抽提，提高了橄榄油中DNA的提取效率。王亚等［22］通过向CTAB提取缓冲液中加入PVP和巯基乙醇，经酚/三氯甲烷抽提，最后用异丙醇和醋酸铵沉淀油脂中DNA，取得了不错的效果。

CTAB法提取DNA成本较低，不需要昂贵仪器和试剂，操作简单，具有普遍的适用性。但该法比较耗时，容易造成提取过程中DNA的损失，而且提取过程中用到酚、三氯甲烷等有毒试剂，因此CTAB法在食用油DNA提取方面还具有一定的局限性。

2.2 SDS(十二烷基磺酸钠)法

SDS法也是一种分子生物学中常用的DNA提取方法。与CTAB不同，SDS是一种阴离子去垢剂，在高温条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，同时SDS能与蛋白质及多糖结合成复合物，释放出核酸。通过提高盐浓度并降低温度，使SDS-蛋白质复合物的溶解度变得更小，从而使蛋白质及多糖杂质沉淀。上清液经酚/氯仿反复抽提后用乙醇沉淀DNA。

传统的SDS提取缓冲液，包含Tris-HCl，EDTA，NaCl，巯基乙醇和 SDS［23］。SDS 法最初也主要用于植物DNA的提取［24］。在后来的应用中，SDS法经过一步步改良，不断完善，所获得的DNA质量和产量也逐渐提高，已经成为DNA提取的一种较好的方法。

根据食用油的特点和性质，Maja Hellebrand［6］等利用SDS法成功的从精炼菜籽油中提取到菜籽DNA。他们首先向预处理后的菜籽油加入SDS提取液，并添加蛋白酶K，后经酚/氯仿抽提，最后用乙醇沉淀DNA。结果发现，在粗制油和精炼菜籽油中均可以提取到DNA，并能成功进行 PCR扩增。许冬倩［25］等对SDS法进行改良，省去了酚/三氯甲烷抽提步骤，减少了大豆油DNA的损失，提取的DNA含量高，质量也足以保证PCR反应的要求。

SDS法操作简单而且比较温和，也可提取到高分子量的DNA，但所得到的产物含杂质较多，有一些报道称用SDS法提取的DNA的纯度不如CTAB法提取的高［26－28］。

2.3 异硫氰酸胍(GuSCN)法

异硫氰酸胍是一种蛋白质变性剂，它能使细胞结构迅速被破坏，使核酸从细胞中释放出来。同时高浓度的异硫氰酸胍还使细胞内的核酸酶失活，使释放出的核酸不被降解。

异硫氰酸胍除了用于一般动植物DNA的提取之外，还可用于食用油等深加工产品的DNA提取。Simona Pafundo［29］等使用 Nucleospin Plant试剂盒提取橄榄油中的 DNA，并将提取的 DNA成功的用于AFLD分析，而该试剂盒的裂解液中的主要成分之一为异硫氰酸胍。Wizard试剂盒裂解液中也含有异硫氰酸胍成分。覃文等［8，30］使用Wizard试剂盒提取食用油中的DNA，经实时荧光PCR检测出大豆内源基因Lectin以及外源抗除草剂基因EPSPS，成功的为食用油脂进行核酸类生物性检测提供了一种简捷有效的方法。徐伟丽等［10］针对色拉油中DNA含量低，破坏严重的特点，采用Wizard基因组纯化试剂盒成功检测出大豆的内源基因、抗除草剂基因等。María José Chapela［31］等曾利用 Wizard DNA 纯化试剂盒提取金枪鱼罐头中DNA，结果显示提取的金枪鱼DNA质量良好，并成功地用于PCR扩增。

3 DNA富集和纯化

3.1 磁珠法

磁珠法的核心是将细胞中游离出来的核酸分子吸附到磁性颗粒表面，蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒(即磁珠-DNA混合物)，再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。

磁珠法提取的DNA纯度好，质量高，已经被用于多种复杂及深加工食品的DNA提取。Catherine［32］等对比Wizard试剂盒磁珠，硅胶和羟基磷灰石3种材料吸附提取橄榄油中的DNA，提取发现Wizard磁珠试剂盒法对橄榄油DNA提取效果最好，提取的DNA可用于微卫星分析。Wu［2］等比较了Wizard磁珠纯化试剂盒和CTAB法对大豆油DNA的提取效率，发现磁珠法提取DNA的lectin基因扩增效率更高。

磁珠法提取的DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠，而且磁珠法不需要离心、不需要加入多种试剂，操作简单，符合核酸自动化提取要求，是未来核酸纯化方法发展的一个重要方向。

3.2 离心柱法

离心柱法是将树脂或硅胶膜固定在离心管中，在高盐低pH值条件下，DNA选择性吸附于离心柱内的树脂或膜上，通过漂洗、离心等步骤，去除蛋白和多糖杂质，最后用低盐高pH值的洗脱缓冲液将DNA从树脂或硅胶膜上洗脱。

Joana Costa等［7］使用以离心柱法为原理的 Nucleospin DNA提取试剂盒从精炼油中提取到大豆DNA。Joana等［33］用 Nucleospin DNA 提取试剂盒成功地从大豆油精炼过程中碱炼、水洗、脱色、脱臭等各个环节的油脂产物中提取到高质量的DNA。Innocenzo Muzzalupo［5］等使用 QIAamp DNA 离心柱提取试剂盒提取橄榄油中DNA，能够用于微卫星分析，进行橄榄油品种的鉴别。Rayda Ben Ayed［3］等比较了QIAamp DNA提取试剂盒，Wizard基因组纯化试剂盒和CTAB法对橄榄油中DNA的提取效果，发现QIAamp DNA试剂盒提取DNA的效果最好，能够用于物种鉴定。

栾凤侠等［34］针对食用油脂中提取高纯度和高得率DNA比较难的问题，通过对以离心柱为原理的试剂盒进行改良，用离心柱法从食用油脂中提取到了纯度和浓度均比较高的DNA，并用实时荧光PCR技术成功地检测出了食用油脂中的内源基因和外源基因。程红梅等［35］通过将油和正己烷充分乳化，使残存在油中的DNA交换到缓冲液中，并用自制的离心柱纯化富集DNA，成功从大豆油中提取DNA。

3.3 担体法

在食用油DNA提取过程中，通过添加一定量的DNA或RNA等物质作为担体，能够提高DNA的提取效率，而且不对检测结果产生影响。担体DNA或RNA一般都在沉淀DNA之前加入，而且担体DNA或RNA的选择，最好选择与目标DNA的物种相差较远的植物、动物或微生物DNA或RNA。

王彭等［36］在提取大豆油中DNA过程中，在用无水乙醇沉淀DNA时加入少量东北大豆黑衣33号DNA作为担体，不仅能够提高大豆油中DNA的得率，而且不会影响转基因检测的结果，从而为转基因深加工产品检测过程中的DNA提取提供了新的手段。覃文等［8］在用异丙醇沉淀油脂DNA之前加入植物基因组DNA作为担体，效果良好。白立群［37］在大豆油中DNA富集过程中，比较了线性丙烯酰胺和鲑鱼精DNA作为担体的效果，发现前者富集的DNA扩增效率更高。Giménez等［13］在提取橄榄油中DNA过程中，也使用了线性丙烯酰胺作为担体，且提取效果显著。

4 结语

虽然CTAB法、SDS法提取的DNA纯度能够满足分子生物学实验的一般需要，但是还存在着一定的缺陷，如步骤繁杂，耗时长，DNA损失较大，提取的DNA质量不高等。另外，酚、三氯甲烷等有机溶剂有毒，有损操作者健康。磁珠法和离心柱方法多为一些商业试剂盒采用，它们均采用独特的缓冲液体系，省去了酚/三氯甲烷抽提，减少了DNA的损失，操作简单而高效，提取的DNA质量较高，但成本较高，提取量少。浓缩法和乳化法由于其提取步骤简单，DNA损失较少，而且能极大的富集食用油中DNA。

国内外研究人员对食用油中DNA提取各种方法的提取效果进行了对比。栾凤侠等［34］比较了CTAB法和离心柱法提取精炼大豆油中DNA的效果，结果表明离心柱法操作简单快速，提取的DNA质量高，效果显著优于CTAB法。Andreas Zimmermann等［38］比较了CTAB法，SDS法及离心柱法等9种DNA提取方法在提取大豆深加工产品中的效果，并从DNA质量和产量2个方面进行评价。他们发现，离心柱法提取的DNA量相对低，但是却具有质量高、易进行PCR扩增等特点;相比之下，CTAB、SDS等方法虽然提取的DNA产量较高，但往往导致DNA质量较低，易含有PCR抑制剂。Angela Di Pinto等［39］也发现，试剂盒中采用的磁珠法和离心柱法与CTAB法和SDS法相比，含有相对较少的污染物和PCR抑制剂。

高质量DNA的提取是决定分子生物学实验成败的关键因素。食用油中DNA提取主要包括3个技术环节:(1)样品的前处理;(2)裂解和分离;(3)DNA富集和纯化，其中最重要的环节就是DNA的富集和纯化。随着科技的不断发展，纳米磁珠和生物膜等新型DNA吸附材料未来将会在食用油等深加工产品的DNA提取过程中发挥重大作用，并能极大的提高分子生物学中技术在食品检测中的应用范围。与此同时，还应当提升DNA的后续检测技术的水平，提高其检测灵敏度。

除此之外，随着未来新型油料作物的增加，各种类油的出现，以及食用油掺假、掺杂现象的增加，快速的、高通量结合自动化系统的DNA提取方法的应用将会极大地降低提取时间和成本。

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The Research Development of DNA Isolation in Edible Oil

Zhang Hai-liang1，2，Wu Ya-jun1，Chen Yin-ji2，Ju Xing-rong2，Chen Ying1
1(Institute of Food Safety，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100123，China)2(College of Food Science and Engineering，Nanjing University of Finance and Economics，Nanjing 210003，China)

To verify the production cultivar and authenticity of edible oil using DNA－based molecular methods has become the hot research.however，the bottle neck of the research is DNA isolation.DNA isolation is one of the basic techniques of molecular biology，and extracting DNA with high quality is the key of edible oil research.In this paper，we described several commonly used methods of DNA isolation in edible oil and their research developments in three aspects:(1)sample preparation;(2)lysis and isolation;(3)enrichment and purification of DNA.

food safety，edible oil，DNA isolation

硕士研究生(陈颖教授为通讯作者)。

*科技部转基因重大专项(2008ZX08012);中央级公益性科研院所公益性行业(质检)科研专项(2009JK033)

2010－09－04，改回日期:2010－09－09