大孔树脂提纯苹果类黄酮的研究*

王英，张玉刚，戴洪义

(青岛农业大学园林园艺学院，山东青岛，266109)

大孔树脂提纯苹果类黄酮的研究*

王英，张玉刚，戴洪义

(青岛农业大学园林园艺学院，山东青岛，266109)

研究大孔树脂分离纯化苹果类黄酮工艺。采用AB-8，DM-130，NAK-9三种大孔树脂对苹果类黄酮进行吸附解析，以类黄酮吸附和解析率为指标综合评价，优选出最佳树脂;对优选出的树脂进行吸附和解析条件探讨。结果表明:3种大孔树脂吸附率分别为70.55%，62.45%，74.13%，解析率分别为92.66%，86.84%，87.22%。AB-8树脂综合性能较好。优化AB-8树脂吸附工艺参数为:吸附液浓度0.64mg/mL吸附液pH值6.0，吸附流速1mL/min。解析工艺参数为:解析乙醇体积分数70%，解析流1.6mL/min。苹果类黄酮回收率及纯度分别可达89.46%，为92.50%。

苹果，类黄酮，大孔树脂，纯化

苹果类黄酮粗提物中含有大量的多糖，有机酸等多种杂质，需进一步分离纯化。大孔树脂具有吸附量大、易洗脱、选择性好、强度大、可重复使用等优点，已经广泛地应用于天然植物有效成分的提取和纯化［1－4］。田景振等［5］研究了大孔树脂分离纯化淫羊藿总黄酮的方法，经DM－130型大孔吸附树脂吸附处理后总黄酮纯度较高。韩博等［6］的研究表明，AB-8对甘草类黄酮有较好的吸附和解析性能;王育红等［7］研究表明，NAK-9对苹果多酚的动态吸附工艺。本文对AB-8，DM-130，NAK-9三种大孔树脂对苹果类黄酮的吸附和解析性能进行了筛选，并对AB-8吸附解析条件进行了研究，以期为苹果类黄酮的开发利用提高参考。

1 材料与方法

1.1 材料

青岛农业大学培育的苹果杂种品系95-32(特拉蒙×嘎啦)的果实;芦丁标准品，乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等，均为分析纯;树脂(净品型):AB-8，DM-130，NAK-9(天津市海光化工有限公司)。

冷冻干燥机;HR2006飞利浦搅拌机;KQ-300型数控超声波清洗器(昆山市超声仪有限公司);SBH-ⅢS循环水式多用真空泵;Ultrospec 3300 pro紫外-可见光分光光度计。SBS-100数控计滴部分收集器;HL－2S横流泵;15 mm×250 mm层析柱。

1.2 试验方法

1.2.1 供试液的制备

苹果果皮→冷冻干燥→粉碎→过筛→超声提取→抽滤→减压浓缩→供试液

1.2.2 黄酮测定方法

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系络合化学吸光法［8］。

1.2.3 大孔树脂吸附及解析性能的测定

(1)树脂预处理:3种大孔树脂分别用体积分数95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀，然后用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊，再用去离子水洗至无乙醇，吸干树脂中水分。

(2)树脂吸附率和解析率的测定:准确称量2 g预处理的树脂，置于100mL容量瓶中，加入50mL一定浓度的供试液，振荡吸附24 h(25℃、150 r/min)，测定类黄酮溶液的浓度，计算吸附量。用去离子水洗去残留黄酮后吸干水分，然后加入50mL体积分数80%的乙醇，振荡解析24 h，测定解析液中类黄酮浓度，计算解析量。

式中:B0，供试液浓度;B1，吸附平衡后类黄酮浓度(mg/mL);B2，解析液浓度(mg/mL);Q1，吸附率(%);Q2，解析率(%)。

1.2.4 大孔树脂AB-8，NAK-9静态吸附及解析动力学曲线测定解hkjk析率

准确称量树脂AB-8，NAK-9各2 g，分别放入100mL三角瓶中，加入一定浓度的供试液，振荡5 h内，每隔0.5 h测定一次类黄酮溶液的浓度，绘制静态吸附曲线。

准确称量吸附饱和的树脂AB-8，NAK-9各2 g，分别放入100mL三角瓶中，加入浓度80%酒精进行解析，振荡5 h内，每隔0.5 h测定一次类黄酮溶液的浓度，绘制静态解析曲线。

1.2.5 类黄酮浓度对树脂AB-8吸附效果的影响

称取6份预处理树脂2 g，分别加入不同浓度提取液，振荡24 h测定溶液中剩余类黄酮的浓度。确定最佳吸附浓度。

1.2.6 乙醇浓度对树脂AB-8解析效果的影响

准确称量10份饱和吸附类黄酮的AB-8树脂各2 g，分别加入浓度为不同体积分数乙醇，振荡解析24 h，测定解析液中类黄酮浓度及解析液中可溶性固形物含量。

1.2.7 吸附液pH值对AB-8吸附效果的影响

取预处理的AB-8树脂各2 g，分别加入不同pH值吸附液30mL，振荡24 h测定溶液中剩余类黄酮的浓度。将不同pH值吸附的树脂用去离子水冲洗掉残留类黄酮并将水吸干，加入70%乙醇30mL振荡24 h，根据吸附量和解析量确定最佳吸附pH值。

1.2.8 AB-8树脂对苹果类黄酮的动态吸附试验

根据静态吸附条件，对其动态泄露曲线与动态解析曲线进行考察。将处理好的树脂湿法装入玻璃层析柱中(10 mm×200 mm)，将苹果类黄酮以不同流速上样。将上柱并充分吸附的树脂，以70%乙醇在不同流速下进行解析。每5 min收集一次流出液并测定有效成分的浓度。

1.2.9 苹果类黄酮纯度的测定

分别将粗提液及经AB-8在吸附液浓度0.64mg/mL，吸附液pH值6.0，吸附流速1mL/min，解析乙醇体积分数70%，解析流1.6mL/min条件下纯化的类黄酮解析液进行减压浓缩，冷冻干燥。称取一定干燥物用60%乙醇溶解配成溶液按1.2.2中方法测定溶液中有效成分的含量。

2 结果与讨论

2.1 大孔树脂对苹果类黄酮吸附率和解析性能的测定

由表1可知，极性树脂NAK-9对苹果类黄酮的吸附率较高，弱极性的树脂AB-8次之，弱极性的树脂DM-130对类黄酮的吸附率最低。而弱极性树脂AB-8解析率较高，极性树脂NAK-9对类黄酮解析率较AB-8低，树脂AB-8和NAK-9对类黄酮的解析量差异不明显。弱极性树脂DM-130无论从吸附率还是解析率都没有明显优势。因此，选取 AB-8和NAK-9进行近一步静态吸附和解析试验。

表1 3种大孔树脂对苹果类黄酮的吸附和解析性能

2.2 大孔树脂AB-8，NAK-9静态吸附及解析

由图1(a)可知，大孔树脂AB-8和NAK-9相比较，NAK-9吸附量较高，但由图1(b)解析量来分析，在解析1 h内NAK-9解析量大于AB-8，解析1 h后AB-8解析量大于NAK-9的，NAK-9解析速率小于AB-8，且解析量小于AB-8。因此，选择AB-8对苹果类黄酮进一步进行吸附和解析实验。

为了定量衡量AB-8和NAK-9树脂对苹果类黄酮的吸附速度，用Langmuir单层吸附模型拟合计算AB-8、NAK-9树脂的平衡速率常数。根据 Langmuir［9－10］提出的平衡吸附速率方程:LnQe/(Qe-Qt)=k×t即:-Ln(1－Qt/Qe)=k×t

其中:Qt，t时刻树脂吸附量;Qe，吸附平衡时树脂的吸附量;k:吸附速率常数。

以-ln(1－Qt/Qe)对时间作图得一直线，由斜率可求得树脂苹果类黄酮吸附的平衡速率常数k。

拟合决定系数 R2分别为0.973、0.975 5，说明AB-8、NAK-9树脂与Langmuir单层吸附模型拟合较好。平衡常数k是反映树脂静态吸附的重要参数，吸附速率常数k越小，说明到达平衡所需时间较长。NAK-9的k值小于AB-8的k值，因此NAK-9的吸附速率小于AB-8。

2.3 苹果类黄酮浓度对AB-8树脂吸附的影响

由图3可知，苹果类黄酮浓度是影响树脂吸附性能的重要因素之一。上样浓度低于0.64mg/mL时，随着浓度的增大，AB-8对苹果类黄酮的吸附量逐渐增大。当类黄酮浓度高于0.64mg/mL时，随着浓度的增大，提取液中与类黄酮竞争吸附杂质量也随之增加，使苹果类黄酮在树脂内部扩散能力下降，从而导致树脂吸附量有所下降。

图1 2种树脂静态吸附及解析动力学曲线

图2 树脂对苹果类黄酮的吸附平衡方程

图3 类黄酮浓度对树脂AB-8吸附效果的影响

2.4 乙醇浓度对AB-8解析量的影响

由图4可知，当解析液乙醇体积分数为70%时，类黄酮的解析量最大。乙醇浓度过小，则使解吸剂极性偏大;反之，解吸剂浓度过大，则使得解吸剂极性偏小。由此可见，在进行解吸操作时，解吸剂的浓度不宜过大或者过小，只有当极性合适的情况下才可以达到最佳的效果。

图4 不同浓度乙醇对类黄酮解析效果的影响

2.5 吸附液pH值对AB-8吸附效果的影响

由图5可知，pH值为4、6、10时，树脂对苹果类黄酮的吸附量较大，通过对吸附不同pH吸附液的树脂进行解析发现，吸附液pH值为6时解析量最大。这是由于在pH值为4和10时类黄酮不稳定，是在吸附过程中类黄酮损失造成。因此，pH值为6是最佳吸附条件。

图5 吸附液不同pH对吸附效果的影响

2.6 树脂AB-8吸附流速的选择

通过调节横流泵调节上样液的流速，应以泄漏点最迟出现的吸附流速为宜。当流出液浓度达1/10上样液浓度时视为泄漏点。由图6可知，流速为2.2mL/min时，泄漏点出现最早，在15 min即上液量为33mL;流速为1mL/min时泄漏点最晚出现，在75 min即上液量为75mL;流速为1.6mL/min时泄漏点出现，在35 min即上液量为56mL。吸附流速增大时，泄漏率成增大趋势，这是因为流速过快时，溶质分子来不及扩散到树脂表面就会漏过，因此慢速有利于吸附。

图6 不同进样速度对树脂AB-8吸附性能的影响

2.7 不同吸附流速渗漏曲线考察

按上述操作，变换，以ln(u-y)对流出体积x作图(u即upper bound，应略大于最大值)，求得一元线性回归方程。1mL/min时所得方程为:y=－0.017 4x－2.060 4，R2=0.952 1;1.6mL/min时方程为:y=－0.024 3x－1.906 8，R2=0.960 1;2.2mL/min时，所得方程为:y=－0.035 5x－1.684 7，R2=0.9714。直线斜率以－k表示。经转化整理后，累积渗出浓度与流出液体积关系符合以下单指数方程:y=u(1－e－kx)

图7 不同流速速度拟合线性图

2.8 树脂AB-8解析流速的选择

洗脱速率分别为1、1.6、2.2mL/min时，AB-8型大孔树脂对苹果总黄酮的洗脱率分别为83.2%、89.46%、91.5%。可以看出，洗脱速度为1mL/min时，解析较慢，使得树脂颗粒将被解析的分子物质又从溶剂中吸附过来，生产周期长，且解析率低。洗脱速度为2.2mL时洗脱率高，且洗脱速率高，但乙醇浪费严重。因此选用1.6mL/min进行洗脱。

粗提物中含较高的糖分和其他杂质，其纯度为3.60%，经纯化后纯度可达92.50%。进行纯化后，苹果类黄酮的纯度大大提高。

图8 不同洗脱速度下类黄酮的洗脱效果曲线

3 结论

(1)通过对树脂AB-8，DM-130，NAK-9三种大孔树脂的静态吸附和解析能力测定，结果表明AB-8，DM-130，NAK-9吸附率分别为 70.55%，62.45%，74.13%，解析率分别为92.66%，86.84%，87.22%.极性树脂NAK-9吸附率较弱极性树脂AB-8吸附率大，DM-130吸附率最低;但AB-8解析率明显高于NAK-9和DM-130，AB-8纯化类黄酮回收量高于其他2种树脂。AB-8较适合苹果中类黄酮成分的纯化。

(2)AB-8对苹果类黄酮的最佳吸附条件为:上柱液浓度0.64mg/mL上柱液 pH值6.0，上柱流速1mL/min，解析乙醇体积分数70%，解析速率1.6mL/min。

(3)苹果类黄酮经AB-8大孔树脂纯化后，纯度由3.6%提高至92.5%，回收率为89.46%。

(4)AB-8、NAK-9树脂静态吸附动力学曲线与Langmuir单层吸附模型拟合较好。渗漏曲线中，累积渗出浓度与流出液体积关系符合单指数方程:y=u(1－e－kx)。

［1］Aiken G R，McKnight D M，Thorn K A，et al.Isolation of hydrophilic organic acids from water using nonionic macroporous resins［J］.Organnic Geochemistry，1992，18(4):467－573.

［2］何炳林，史作清.大孔离子交换树脂及新型吸附树脂的结构与性能［J］.高分子通报，2005(4):13－19.

［3］Silva E M，Pompeu D R，Larondelle Y，et al.Optimisation of the adsorption of polyphenols from Inga edulis leaves on macroporous resins using an experimental design methodology［J］.Separation and Purification Techn－ology.2007，53(3):274－280.

［4］Fu Yujie，Zu Yuangang，Liu Wei.Optimization of luteolin separation from pigeonpea［Cajanus cajan(L.)Millsp.］leaves by macroporous resins［J］.Journal of Chromatography A，2006，1 137(2):145－152.

［5］葛淑兰，田景振.大孔吸附树脂对淫羊藿总黄酮的分离纯化工艺研究［J］.中国药学杂志，2005，40(5):365－367.

［6］韩博，陈文，景文娟，等.AB－8大孔吸附树脂对甘草总黄酮的吸附［J］.南方医科大学学报，2007，27(3):265－267.

［7］王育红，朱维军，潘治利，等.NKA 9大孔树脂对苹果多酚的动态吸附工艺优化［J］.农业机械学报，2009，40(8):119－123.

［8］陈阳，王军华，陈亚光，等.红花芸豆色素的提取及稳定性研究［J］.食品科学，2007，28(6):175－179.

Purification of Flavonoid from Apple with Macroporous Resin

Wang Ying，Zhang Yu-gang，Dai Hong-yi
(College of Landscaping and Horticulture，Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China)

To establish a technical procedure for the purification of flavonoids from apple.Three types of macro porous resin(AB-8，DM-130，and NAK-9)were used to absorb and desorb apple flavonoid.The rate of absorption and desorption were compared among the resins.The conditions of absorbability and desorption were further investigated.The absorbability rate of three types of macro porous resin were 70.55%，62.45%，74.13%respectively，The desorption rate were 92.66%，86.84%.87.22%respectively.The results indicated that AB-8 macroporous resin was the best.The optimum adsorption conditions were as follows:sample concentration 64mg/mL，pH6.0 and the feeding rate 1mL/min.The optimum desorption parameters were as follows:ethanol concentration 70%，the flow rate.1.6mL/min.The reclaimed ratio was 89.46% and the purity of the flavonoids extracted from apple fruit was 92.5%.

apple，flavonoid，macroporous resin，purification

硕士研究生(戴洪义为通讯作者)。

*国家“十一五”科技支撑计划项目(2008BAD92B01);国家现代苹果产业技术体系项目(XDNYCYTX);山东良种产业化工程项目

2010－08－05，改回日期:2010－09－15