重瓣葵黄色素超声提取工艺*

孔冬梅

(山西大学生命科学学院，山西太原，030006)

重瓣葵黄色素超声提取工艺*

孔冬梅

(山西大学生命科学学院，山西太原，030006)

对重瓣葵花瓣黄色素的提取工艺进行了探索，旨在开发新的天然色素资源，为工业化提取重瓣葵黄色素提供实验依据。采用超声有机溶剂浸提，以提取液在最大吸收波长下的吸光度表示提取效果。在单因素试验的基础上，采用二次回归正交旋转组合设计的实验方法，建立了提取温度、液料比、提取剂浓度与提取效果之间的经验数学模型。结果表明:适宜提取工艺条件为提取温度50℃、液料比40∶1(mL∶g)、乙醇体积分数70%，超声处理15 min，恒温浸提3 h，在此条件下，重瓣葵黄色素提取液的吸光度为0.781。

重瓣葵，黄色素，二次回归正交旋转组合设计，超声提取

重瓣葵(Helianthus annuus var.nanus flore-pleno)是菊科向日葵(H.annuus)的变种，为多年生宿根草本花卉，原产北美，近年引入我国并试种成功，现已广泛栽培。重瓣葵头状花序生于枝端，球形硕大，直径达30cm，开花数量多，花期长，花瓣金黄，色彩艳丽，可用于提取色素［1－5］。本试验采用超声有机溶剂浸提，并设计了二次回归正交旋转组合实验，对重瓣葵黄色素的提取工艺进行系统研究。

1 材料、仪器与试剂

1.1 实验材料

重瓣葵花瓣，采自吉林白城师范学院校园，经山西农业大学吕晋慧副教授鉴定，干燥粉碎后过40目筛的样品作为实验样品。

1.2 主要仪器

722型光栅分光光度计(上海精科)，恒温水浴锅(国华电器有限公司)，MT/FA系列电子分析天平(北京美泰科仪检测仪器有限公司)，250H超声波清洗器(800W)(上海科导超声仪器有限公司)，样品筛等。

1.3 实验试剂

无水乙醇、异丙醇、丙酮、三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、石油醚(天津化学试剂有限公司，均为分析纯试剂)。

2 实验方法

2.1 提取方法

重瓣葵黄色素提取工艺流程如下:

花瓣干粉浸入一定体积的提取液→超声处理→溶剂浸提→离心→色素液(定容到一定体积，4℃保存)

2.2 波长的选择

准确称取样品0.5 g，用30mL无水乙醇浸提，800 W功率超声处理15 min后，室温振荡3 h，离心。取5mL浸提液，放入1cm比色杯，测定可见光区不同波长下的吸光度，确定最大吸收波长λmax。文中实验以最大波长测样品。超声处理下同。

2.3 提取剂的选择

选用蒸馏水、无水乙醇、异丙醇、丙酮、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、石油醚等极性不同的8种溶剂进行浸提试验。准确称取样品8份，每份1.0 g，分别放入100mL三角瓶中，依次加入30mL溶剂，超声后室温振荡浸提3 h。离心，定容提取液至50mL，在最大波长下测浸提液吸光度。

2.4 乙醇浓度对色素提取的影响

配制体积分数 50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液，准确称取样品6份，每份0.5 g，放入100mL三角瓶中。依次加入30mL不同浓度的乙醇溶液，超声后室温振荡浸提3 h，离心后定容至50mL。在λmax下用分光光度计测量浸提液吸光度。

2.5 提取时间对色素提取的影响

准确称取样品7份，每份0.2 g，放入100mL三角瓶中，分别加入70%乙醇10mL。超声后室温振荡浸提，每隔30 min离心一份，定容到10mL，在λmax下用分光光度计测量提取液吸光度。

2.6 提取温度对色素提取的影响

准确称取样品每份0.2 g，加入到11个三角瓶中，分别加入70%乙醇10mL，并依次调整温度为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃，超声后恒温水浴振荡1 h，离心后上清液定容到10mL，在λmax下用分光光度计测量提取液吸光度。

2.7 液料比对色素提取的影响

准确称取样品5份，每份1.0 g，加入到三角瓶中，分别加入 70% 乙醇 10、20、30、40、50mL，超声后，35℃下恒温水浴振荡1 h，离心后上清液定容到50mL，在λmax下用分光光度计测量提取液吸光度。

为了使重瓣葵黄色素的吸光度达到最大，在预先单因素试验与观察的基础上，利用超声处理浸提物15 min后，恒温振荡浸提3 h，设计三因素二次回归正交旋转组合试验(表1)。

2.8 提取工艺条件优化实验设计

表1 二次回归正交旋转组合设计因素水平编码表

3个单因素分别为温度、液料比、乙醇浓度3个外界因子，为自变量，分别以 X1、X2、X3表示，并以 +1、0、－1 分别代表自变量的高、中、低水平［6］。采用DPS统计分析软件进行数据处理、回归方程的推导以及方差分析、两因素交互效应曲面的制作，进而研究各因素对重瓣葵花瓣黄色素提取液吸光度影响的规律。

3 结果与分析

3.1 波长的确定

重瓣葵黄色素浸提液在可见光区的吸收曲线如图1所示。由图1曲线可看出，在280 nm处和440 nm处出现了2个吸收峰，在440 nm处达到了最大吸光度OD，故最大吸收波长确定为440 nm，即λmax为440 nm。

3.2 浸提剂的选择

浸提实验结果表明:超声15 min，在3 h内提取后，重瓣葵花瓣黄色素在各种溶剂中的溶解度不同(如图2)。在异丙醇中溶解度最大，测得的OD值为1.372，其次为丙酮、无水乙醇和乙醚。单因素方差分析发现这4种提取液之间OD值差异不显著。可见重瓣葵黄色素为水溶性色素，易溶于极性较强的溶剂。重瓣葵黄色素在异丙醇、丙酮中溶解度均稍高于无水乙醇，但异丙醇不易挥发，残留在色素液中不易去除;丙酮虽易挥发，但人体吸入后易引起不适反应。乙醚挥发性也较强，但其异味和毒性较大，故在生产中一般不采用。而无水乙醇挥发性好，无毒无残留，据此确定选择乙醇作为浸提剂较合适。

图1 重瓣葵黄色素浸提液在可见光区的吸收曲线

图2 提取剂对色素提取的影响

3.3 乙醇浓度对色素提取的影响

从图3可知，乙醇在体积分数为50%～60%内，重瓣葵黄色素的吸光度明显低于乙醇体积分数为70%以上的吸光度;乙醇体积分数在70%～100%时，以无水乙醇的浸提效果最优，其余依次为70% ＞90% ＞80%，单因素方差分析表明70%、80%、90%3种乙醇浓度间提取效果无显著性差异。而与不同浓度的乙醇相比，无水乙醇更易挥发，不易控制，且成本较高，因而在生产中较少用。

图3 乙醇浓度对色素提取的影响

3.4 浸提时间对色素提取的影响

由图4可看出，在30～210 min内，吸光度随提取时间的延长而增加。在30～170 min内吸光度增加较明显;在170～210 min内，吸光度增加不明显，趋于平缓;浸提180 min已达到最大吸光度，之后随时间延长，吸光度无明显增加。

图4 浸提时间对色素提取的影响

3.5 浸提温度对色素提取的影响

如图5所示，在低于50℃时，浸提液吸光度随提取温度升高而增加，在50℃时的吸光度达到最大值0.715;当浸提温度高于50℃时，随温度的逐渐提高，吸光度没有增加的趋势。

图5 浸提温度对色素提取的影响

3.6 浸提液料比对色素提取的影响

由图6可知，液料比在10∶1～50∶1内，随液料比的升高，提取液的吸光度呈先升高后降低的趋势，在40∶1处有一个最高峰值。

图6 液料比对色素提取的影响

3.7 提取工艺条件优化

3.7.1 回归模型的建立和检验

在上述单因素试验结果的基础上，采用三因素二次回归正交旋转组合试验设计方案，共设计出23个处理组，结果见表2。对试验结果利用DPS软件进行分析，得到重瓣葵黄色素提取液的吸光度(Y)与温度(X1)、液料比(X2)、乙醇浓度(X3)三因素在编码空间的多元回归模型如下:

Y=0.629 19+0.081 48X1－0.023 46X2+0.030 84X3+0.002 61X12－0.014 36X22－0.032 21X32－0.007 50X1X2－0.033 50X1X3－0.023 00X2X3

表2 二次回归正交旋转组合设计试验安排及结果

对回归方程的模拟实验结果进行方差分析，结果见表3。

由表3可见，失拟性检验 F1=6.585，小于F0.01(5，8)=6.63，不显著，表明失拟平方和其他不可忽略的因素对试验结果的影响很小，说明所选用的二次回归模型是适当的。回归方程显著性检验F2=136.950，大于 F0.01(9，13)=4.19，表明回归方程达到极显著，反应出方程式在试验点上与试验结果相吻合，模型成立。

对回归系数进行显著性检验，在α=0.1显著水平下剔除不显著项，得到简化后的方程为:

Y=0.629 19+0.081 48X1－0.023 46X2+0.030 84X3－0.014 36X22－0.032 21X32－0.007 50X1X2－0.033 50X1X3－0.023 00X2X3

表3 回归模拟的方差分析表

3.7.2 主因子效应分析

从表3可以得出:MS X1=0.090 7;MS X2=0.007 5;MS X3=0.013 0。所以，影响重瓣葵黄色素提取的3个因素主次顺序是:提取温度＞乙醇浓度＞液料比。

3.7.3 单因子效应分析

从图7可以看出，各个曲线的变化趋势与试验所做的单因素曲线图趋势基本吻合。这一现象表明，提取温度、液料比和提取溶剂浓度对重瓣葵黄色素提取的影响趋势与单因素所反映的基本一致，可为日后生产放大选择参数提供一定的依据。

3.7.4 互作效应分析

固定方程中的一个因素，可得出另2因素与重瓣葵黄色素吸光度关系的子模型。根据二次回归方程，建立响应曲面图，可以直观地反映交互对应关系(图7)。

图7 单因子效应分析图

3.7.4.1 提取温度和液料比交互作用对吸光度的影响

将乙醇体积分数X3固定在零水平，得到液料比X2和温度X1对吸光度Y的影响方程:

Y=0.629 19+0.081 48X1－0.023 46X2+0.002 61X12－0.014 36X22－0.007 50X1X2

从图8可以看出，当固定乙醇浓度时，随着温度的增加，色素提取液吸光度增加，尤其在35～50℃吸光度增加较快;在任何温度水平，吸光度随液料比的增加基本呈上升趋势，但变化速度较慢。当温度在45～50℃，液料比在30∶1～40∶1时，吸光度处在一个较高水平。

图8 提取温度和液料比交互作用对色素提取的影响

3.7.4.2 温度和乙醇浓度交互作用对吸光度的影响

将液料比X2固定在零水平，得到温度X1和乙醇浓度X3对吸光度Y的影响方程:

Y=0.629 19+0.081 48X1+0.030 84X3+0.002 61X12－0.032 21X32－0.033 50X1X3

从图9可以看出，当固定液料比时，吸光度随温度的增加呈上升趋势;在较低温度范围内时，吸光度随乙醇浓度的增加而增加，而在较高温度范围内时，吸光度随乙醇浓度的增加呈抛物线的变化，表明乙醇浓度只有在一个适中的范围才能使吸光度达到最大。总的来说，当温度在50℃左右，乙醇体积分数在65%～70%时，吸光度处在较高水平。

图9 温度和乙醇浓度交互作用对色素提取的影响

3.7.4.3 液料比和乙醇浓度交互作用对吸光度的影响

将温度X1固定在零水平，得到液料比X2和乙醇浓度X3对吸光度Y的影响方程:

Y=0.629 19－0.023 46X2+0.030 84X3－0.014 36X22－0.032 21X32－0.023 00X2X3

从图10可以看出，当固定温度时，在较低乙醇浓度范围内，吸光度随液料比的增加呈不明显的抛物线变化，在较高乙醇浓度范围内，吸光度随液料比的增加而增加;在较低液料比时，吸光度随乙醇浓度增加呈不明显的抛物线变化，在较高液料比时，吸光度随乙醇浓度的增加基本上呈增加趋势。只有当液料比和乙醇浓度均取值适中时，才会获得最大吸光度。图中显示，液料比在35∶1～40∶1，乙醇浓度在70%～80%时，吸光度处于较高水平。

图10 液料比和乙醇浓度交互作用对色素提取的影响

3.7.5 最适工艺条件的选择

以0.60作为吸光度的临界值，大于0.60的53个实验方案中各变量的取值频率分布如表4所示。由表4结合预先的单因素试验分析，确定最佳提取工艺条件为温度50℃、液料比40∶1、乙醇体积分数70%，在此条件下的黄色素吸光度的预测值为0.790。对这一组合进行验证，重复3次，得到实测平均值为0.781，模型误差为1.15%，表明模型拟合较好，回归方程可靠。

表4 提取液吸光度大于0.60的53个方案

4 结论

(1)在预先单因素试验的基础上，采用三因素二次回归正交旋转组合设计方法对重瓣葵黄色素提取工艺条件进行优化，建立了提取液吸光度Y与温度X1、液料比X2和乙醇浓度X3之间的回归模型为:

Y=0.629 19+0.081 48X1－0.023 46X2+0.030 84X3+0.002 61X12－0.014 36X22－0.032 21X32－0.007 50X1X2－0.033 50X1X3－0.023 00X2X3

(2)根据模拟结果确定3个因素对重瓣葵花瓣黄色素提取效果的影响大小依次为提取温度＞乙醇浓度＞液料比;最佳提取工艺条件为液料比40∶1、温度50℃、乙醇体积分数70%，在此条件下黄色素提取液吸光度的模拟值为0.790，实测值为0.781;通过验证实验证明，该模型与实际情况吻合良好，对实际生产具有指导意义。

(3)重瓣葵花瓣黄色素为水溶性色素，尤其在无水乙醇、异丙醇、丙酮中溶解度最大，在乙醚中溶解度也较大。有关重瓣葵黄色素的功能活性及其他理化性质还有待进一步研究。

致谢:感谢吉林白城师范学院丛建民博士在实验设计和数据分析中给予的帮助。

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Study on Ultrasonic Extraction of Yellow Pigment from Sunflower

Kong Dong-mei
(College of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006 China)

Extraction process of the yellow pigment from sunflower(Helianthus annuus var.nanus flore-pleno)was optimized on the basis of the preliminary exploration.The study was designed to provide a theoretical basis for the development of new pigment resources and the industrialized extraction.Organic solvent extraction was carried out.Extraction effect was represented with the absorbance of extracting solution under the maximum absorption wavelength.Quadratic regression orthogonal rotary tests were designed on the basis of single factor experiments.And the mathematical model of correlation among temperature，ratio of solvent to material，concentration of solvent and extraction effect was established.The results showed that the optimum extraction conditions were:the ratio of solvent to material 40∶1(mL∶g)with 70%ethanol，ultrasound treatment 15 min，extraction time 3 h under the constant temperature of 50℃.Under the above conditions，the absorbance of the yellow pigment was 0.781.

Helianthus annuus var.nanus flore-pleno，yellow pigment，quadratic regression orthogonal rotary tests，ultrasonic extraction

博士，讲师。

*山西大学青年科技基金(2007108)

2010－07－15，改回日期:2010－09－15