双向纸电泳-纸层析结合法测定酵母核酸水解的4种核苷酸*

张一平，华洵璐，孙梅，谢骏，匡群，何义进

1(中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室，江苏无锡，214081)2(江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏无锡，214063)

双向纸电泳-纸层析结合法测定酵母核酸水解的4种核苷酸*

张一平1，2，华洵璐1，2，孙梅1，2，谢骏1，匡群1，2，何义进1

1(中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室，江苏无锡，214081)2(江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏无锡，214063)

建立了酵母核酸水解率简便、准确、低成本测定方法。采用双向纸电泳-纸层析结合法同时测定酵母核酸水解的4种单体核苷酸;采用变异系数(CV)和平均回收率分析该测定方法的精密度和准确度。结果表明，10%醋酸电泳结合饱和硫酸铵∶1mol/L醋酸铵∶异丙醇(体积比，80∶18∶2)的展层剂，能同时分离4种核苷酸;测定相关系数R均大于0.985;测定核苷酸标准品混合液的变异系数分别为AMP 1.30%、GMP 1.44%、CMP 1.36%、UMP 1.31%;测定酵母RNA水解液对应的变异系数分别为2.45%、2.01%、2.75%、2.06%;回收率在94.80%～106.57%，最低检出限在0.65～0.72mg/mL。

核酸，核苷酸，纸层析，纸电泳

核酸RNA是重要的生物大分子，在生物体的遗传变异、生长发育以及蛋白质合成中起着重要作用［1］。核酸用5’-磷酸二酯酶催化水解，控制反应条件，可获得腺苷酸(AMP)、鸟苷酸(GMP)、胞苷酸(CMP)、尿苷酸(UMP)4种小分子的单体核苷酸［2］。核苷酸是一类具有重要生理功能的物质［3］，广泛应用于医药、食品工业［4］，农业上可作为植物生长促进剂［5］，饲料上可用作安全高效的添加剂［6］，尤其对于能耐受较高剂量核苷酸的水生动物效果更明显［7－8］。

啤酒废酵母是啤酒工业主要副产物，其中RNA含量为6%～8%，是生产核苷酸产品的绝好原料［9］。近年来综合利用啤酒废酵母提取核苷酸的研究越来越多，促进了对核酸水解产物核苷酸分析方法的研究。

目前国内外测定核苷酸的方法，主要分为反相高效液相色谱法［10－11］、高效毛细管电泳法［12－13］和离子交换液相色谱法［14－15］。反相高效液相色谱法具有快速、准确的优点，但分离的核苷酸种类有限，如果要分离核苷酸种类较多的样品，必须采用繁琐的梯度洗脱法，因此该方法具有一定的局限性。高效毛细管电泳法具有很高的分离效率，能将各种核苷酸很好地分离，具有快速、污染小的特点，但目前所用仪器主要靠进口，价格昂贵，使用受到一定条件的限制。离子交换色谱法具有较高的分离效率，尤其对于核苷酸、氨基酸这些生物体中的兼性离子化合物，能很好地将其分离，但需要对分离柱进行平衡(再生)，分析时间比较长，主要用于生物学、医学和食品等的分析［16］。

以上方法的共同缺陷是操作复杂、测定成本高。本论文根据酵母RNA降解产物的复杂程度，针对核苷酸的带电量以及分子量差异的特点，对分离4种核苷酸的电泳系统和层析溶剂进行筛选试验，采用纸电泳—纸层析结合法同时分离测定4种核苷酸。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料

麦芽根:购自中粮麦芽(江阴)有限公司。酵母RNA:用啤酒废酵母自制，RNA纯度90%。蒸馏水:购自无锡华晶飘之霖有限公司。

1.1.2 主要试剂和标准品

冰醋酸、柠檬酸、柠檬酸钠、异戊醇、异丁醇、异丙醇、吡啶、95% 乙醇、硼砂、硼酸、NaCo3、NaHCo3、醋酸钠、醋酸铵、HCl、(NH4)2SO4、ZnSO4、MgSO4:均为分析纯，国药上海化学试剂公司。AMP、GMP、UMP、CMP标准品:均为生化试剂级，购自Sigma公司。

滤纸:采用国产新华1号，长30cm，宽15cm。

1.1.3 主要仪器和设备

AE-100电子分析天平(0.000 1 g)、DYY-6C型电泳仪、TDL-40B台式低速离心机、751紫外分光光度计、紫外显色仪、层析缸。

1.2 方法

1.2.1 纸电泳缓冲液

缓冲液Ⅰ:10%醋酸;缓冲液Ⅱ:0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3.5);缓冲液Ⅲ:0.2mol/L乙酸-乙酸钠(pH值5.0);缓冲液Ⅳ:0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠(pH值10.8)缓冲液Ⅴ:0.2mol/L硼酸-硼砂(pH值9.0)

1.2.2 纸层析溶剂系统

溶剂系统Ⅰ:V(异戊醇)∶V(5%柠檬酸钠)=1∶1;溶剂系统Ⅱ:V(异丁醇)∶V(吡啶)∶V(醋酸)∶V(水)=12∶6∶1∶4;溶剂系统Ⅲ:V(95% 乙醇)∶V(醋酸钠)=7∶3(用醋酸调pH 5.0)溶剂系统Ⅳ:V(异丁醇)∶V(15N 硫酸铵)∶V(0.1mol/L 硼酸)=6∶1∶3;溶剂系统Ⅴ:V(饱和硫酸铵)∶V(1mol/L醋酸铵)∶V(异丙醇)=80∶18∶2。

1.2.3 标准曲线的建立方法

精确称取UMP标准品1 g，溶解于50mL蒸馏水中;分别吸取3mL、4mL、5mL、6mL、7mL 于 10mL容量瓶中，定容，对应的浓度分别为 6、8、10、12、14mg/mL。各标准溶液分别走纸电泳(点样量5μL，电泳2 h，电压500 V)。电泳结束后，晾干;逆时针旋转90°后，放于层析缸中走纸层析8 h。

将层析纸晾干或烘干后，紫外仪(波长2537A)下观看层析斑。将斑点剪下，用5mL的0.1mol/L HCl浸提3 h(每隔15 min振摇1次);4 000 r/min离心10 min，取上清液紫外分光光度计测定紫外吸收值，0.1mol/L HCl为参比对照。以OD值为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制UMP标准曲线。

AMP、GMP、CMP标准曲线的建立与UMP相同，只是改用蒸馏水作为浸提液。

1.2.4 核苷酸混合液的制备

标准品混合液:精确称取 AMP、GMP、UMP、CMP标准品各2.5 g，一起溶解于100mL蒸馏水中，每种核苷酸的浓度均为25mg/mL。

已知浓度的核苷酸混合液:从酵母RNA酶解、纯化制得，含 AMP 8.72mg/mL、GMP 9.67mg/mL、UMP 6.80mg/mL、CMP 8.10mg/mL。

1.2.5 酵母核酸RNA水解样的制备

将新鲜、干燥的麦芽根30 g，粉碎，过80目筛;加入300mL水，搅拌;置4℃冰箱浸泡18 h;4层纱布过滤，滤液4 000 r/min离心5 min;上清液70℃水浴5 min灭杂酶后，即为5’-磷酸二酯酶粗酶液。称取80 g酵母RNA，溶解于1 200mL水中;2mol/L NaOH调节 pH7.0，加入 0.2mol/L 的 MgSO4、10－3mol/L 的ZnSO4，然后倒入粗酶液;70℃水浴搅拌反应2 h;升温至90℃灭酶5 min。测定水解液中4种核苷酸的含量。

1.2.6 测定误差分析方法

精密度的高低用变异系数(CV)表示、准确度用平均加标回收率表示;包括标准偏差(S)、最低检出限(DL)等的计算公式参见文献［17］。

2 结果与分析

2.1 4种单体核苷酸在不同纸电泳系统中的迁移效果

将浓度为10mg/mL的核苷酸标准品溶液分别点样至不同缓冲液中，电泳2 h，电压500 V，结果见表1。

表1 四种核苷酸在不同电泳缓冲液中的迁移距离

由表1可知，只有10%的醋酸和乙酸-乙酸钠缓冲液能将GMP和UMP单独地分离出来;而其他3种缓冲液只能分离出1种核苷酸。考虑到配制溶液的方便性，选择10%醋酸作为电泳缓冲液。

2.2 4种单体核苷酸在双向纸电泳-纸层极系统中的分离效果

由于AMP和CMP在10%醋酸电泳液中迁移距离相近，不能单独分开，所以必须寻找一种能将两者分开的溶剂系统。本论文将浓度为10mg/mL的核苷酸标准品溶液分别先在10%醋酸电泳液中走纸电泳，然后逆时针旋转90°，再在不同的溶剂系统中走纸层析(层析8 h)，结果见表2。

表2 四种核苷酸先10%醋酸纸电泳-再纸层析的Rf值

由表2可知，溶剂系统(V)其AMP与CMP的Rf值相差最大，所以选择该溶剂作为电泳后的纸层析溶剂系统。

2.3 双向纸电泳-纸层析系统对四种核苷酸混合液的分离效果影响

以上实验均是将单独的核苷酸点样后的结果，为了更进一步确定该纸电泳-纸层析系统同时分离4种核苷酸的效果，取浓度各为25mg/mL的标准品混合液，先走纸电泳，然后逆时针旋转90°，再走纸层析，结果见图1、图2。

图1 四种核苷酸混合液在10%醋酸电泳液中的电泳结果

图2 四种核苷酸混合液在溶剂系统(V)中的层析结果

从图1可知，4种核苷酸的混合液，经10%醋酸电泳后，能清楚地分离出 GMP和 UMP，最上面是UMP斑点、中间是GMP斑点，而最下面的是AMP和CMP的混合点。

从图2可知，4种核苷酸的混合液先走纸电泳，再走纸层析，能将AMP和CMP有效地分开，CMP的位置在AMP的正上方，且距离相差很大。

2.4 双向纸电泳—纸层析结合法测定4种核苷酸标准曲线的建立

先以10%醋酸电泳系统，再以V(饱和硫酸铵)∶V(1M 醋酸铵)∶V(异丙醇)=80∶18∶2 为纸层析溶剂系统，按照1.2.3小节的描述，分别建立4种核苷酸的测定用标准曲线，结果见图3－图6。

图3 AMP标准曲线

图4 GMP标准曲线

图5 UMP标准曲线

图6 CMP标准曲线

由上图3～图6可知，在实验浓度范围内，紫外吸收值(OD值)与浓度呈良好的线性关系。相关系数R均在0.985以上，表明OD值与浓度之间有较精确的相互关系。由此得出“双向纸电泳-纸层析结合法”测定核苷酸的计算公式为:

AMP含量(mg/mL)=1/0.034×OD259×稀释倍数=29.41×OD259×稀释倍数

GMP含量(mg/mL)=1/0.017×OD262.5×稀释倍数=58.82×OD262.5×稀释倍数

CMP含量(mg/mL)=1/0.016×OD260×稀释倍数=62.50×OD260×稀释倍数

UMP含量(mg/mL)=1/0.020×OD262×稀释倍数=50.00×OD262×稀释倍数

2.5 “双向纸电泳-纸层析结合法”的精密度测定

按照1.2.4小节的描述，配制核苷酸标准品混合液1份(每种核苷酸的浓度均为25mg/mL)，在同一天连续进行5次测定，结果见表3。

表3 “双向纸电泳—纸层析结合法”的精密度结果

从表3可知，4种核苷酸的变异系数CV均≤2.0%，表明该方法测定的精密度结果符合分析要求。以2倍信噪比计算的 AMP、GMP、CMP、UMP的最低检出限分别为 0.65、0.72、0.68、0.65mg/mL。

2.6 “双向纸电泳-纸层析结合法”的准确度测定

取已知浓度的核苷酸混合液1份，加入不同质量浓度的标准品混合液，制备成高(约20mg/mL)、中(约15mg/mL)、低(约10mg/mL)3个浓度的混合液，测定3次求平均值，计算平均回收率，结果见表4。

表4 “双向纸电泳—纸层析结合法”的回收率测定结果

由表4可知，AMP的回收率在 95.20%～98.62%、GMP的回收率在 101.46%～106.57%、CMP的的回收率在94.80%～96.92%、UMP的回收率在98.43%～100.40%，回收率达到理想效果，表明该方法具有较高的准确度，完全可以用于核酸水解率的测定。

2.7 “双向纸电泳-纸层析结合法”测定酵母核酸RNA水解样中四种核苷酸的含量

按照1.2.5小节的描述，制备酵母核酸RNA酶水解液共5个批次，测定样液中的核苷酸含量，结果见表5。

表5 磷酸二酯酶水解酵母核酸RNA样液中四种核苷酸的测定结果

从表5可知，5个批次酵母核酸RNA水解样的测定结果表明，4种核苷酸的变异系数在2.01%～2.75%，数据的重复性仍旧较好，其精密度仍在仪器分析要求之内，可以满足酵母核酸水解率测定的需要。

3 讨论

尽管我国的国家标准与行业标准有肌苷酸和鸟苷酸的检测方法［18～19］，但由于酵母核酸RNA水解产物的复杂性，4种单体核苷酸混合在一起，且仅是产物的一部分，因此无法直接引用这些标准进行检测。目前采用的高效液相色谱等方法，需要通过梯度洗脱分离出纯核苷酸才能检测，操作非常复杂，且仪器设备要求高，测定成本高。而如果单纯采用纸电泳法或纸层析法，却无法找到一种溶剂系统能同时分离这4种核苷酸。

本论文针对上述难题，首先对核苷酸的纸电泳系统和纸层析展开剂进行了大量筛选实验，最终寻找到了一种纸电泳和纸层析结合系统能将四种核苷酸完全地分开，从而建立了一种新的酵母核酸水解产物测定方法。对于核苷酸标准品混合液以及酵母核酸RNA水解液，该测定方法5次重复测定的变异系数分别在1.30%～1.44%和2.01%～2.75%，最低检出限 0.65～0.72mg/mL，准确度 94.80% ～106.57%，表明其精密度和准确度结果与高效液色谱等方法相近［10－16］。

本论文建立的测定方法最大优点是操作简单、仪器要求不高、测定成本低，可一次性同时测定出4种核苷酸的含量。

在采用酵母细胞生产核苷酸的工艺过程中，急需建立一种简单、准确、廉价的分析定量方法进行生产过程监控和产品质量控制，本论文建立的测定方法具有实际应用意义。对于保健品、食品、食用菌等产品中的核苷酸检测，该方法也具有一定的推广价值。

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Determination of Four Nucleotides from Yeast RNA Hydrolysate Combined the Methods of Paper Electrophoresis and Paper Chromatography

Zhang Yi-ping1，2，Hua Xun-lu1，2，Sun Mei1，2，Xie Jun1，Kuang Qun1，2，He Yi-jin1
1(Key Laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of Freshwater Fishes，Ministry of Agriculture，Freshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Science，Wuxi 214081，China)2(Jiangsu limited company of Suwei microbiology，Wuxi 214063，China)

To establish the simple，accurate and inexpensive determination method of yeast RNA hydrolyzed yield.Method:The four single nucleotides of RNA hydrolysate were determined by the combined methods of paper electrophoresis and paper chromatography;the precision and accuracy of this method were analyzed using coefficient of cariation(CV)and average recovery .Result:Combined the 10%acetic acid buffer and the saturated(NH4)2SO4∶1M ammonium acetate∶isopropanol(80∶18∶2，V/V);developing solvent，the four single nucleotides could be separated simultaneously;the relative coefficient(R)were all more than 0.985;the CV value of AMP，GMP，CMP，UMP was 1.30%，1.44%，1.36%and 1.30%respectively in the standard nucleotides mixture sample，while the CV value was 2.45%，2.01%，2.75%and 2.06%respectively in the yeast RNA hydrolization liquid;the average ratio of recovery were between 94.80%and 106.57%;the minimum detection limit were between 0.65～0.72mg/mL.Conclusion:The determination method deployed in this paper had the advantages of meticulous precision，high degree of accuracy，lower investment of instrument and cheaper cost，so it can be promoted widely.

nucleic acid，nucleotides，paper electrophoresis，paper chromatography

学士，副研究员。

*农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室开放基金资助项目:新型安全高效水产饲料添加剂——酵母核苷酸的研究开发(BZ2009);2008农业部农业科技成果转化资金项目:生态高效规范化淡水养殖关键技术示范(2008GB2C100110)。

2010－04－27