过氧化物酶体增殖因子活化受体γ在大肠癌中的表达及意义

马元华 郑发寿 樊晓明 张友元

(复旦大学附属金山医院消化科,*病理科,上海 200540)

过氧化物酶体增殖因子活化受体(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPAR-γ)是一类由配体激活的核转录因子,属核激素受体超家族成员,在脂代谢和糖代谢中起重要的调节作用[1]。近年来发现PPAR-γ在多种肿瘤细胞(如乳腺癌、胃癌、肺癌等)中表达,其经 PPAR-γ的配体作用后能诱导上述细胞的分化和凋亡。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助蛋白,对DNA的复制和细胞的增殖有重要作用,PCNA在增生细胞中的表达有明显的周期性,是一个评价细胞增殖的较好的指标。本实验通过研究PPAR-γ、PCNA在不同类型大肠癌中表达,探讨其与大肠癌病理特征之间的关系,以及在大肠癌细胞增殖分化中的作用。

1 资料与方法

1.1 标本来源 本研究56例大肠癌标本均取自复旦大学附属金山医院普外科2004—2005年接受手术治疗的患者,全部经病理检查确诊,均带有癌旁正常组织。其中男性31例,女性25例;年龄32～86岁,中位年龄61岁。

1.2 免疫组织化学染色 术后立即取组织标本,经4%福尔马林浸泡固定后,脱水、透明、浸蜡包埋,制成4μm厚连续切片,常规脱蜡至水。免疫组织化学检测采用En vision两步法,一抗兔抗人PPAR-γ多抗购自武汉博士德生物工程有限公司,工作浓度为1:50;PCNA单抗购自福州迈新生物技术开发有限公司,工作浓度为1:100;PBS代替一抗作阴性对照,37℃孵育2 h。充分洗涤后,滴加购自上海长岛抗体诊断试剂公司的即用型羊抗鼠、兔的二抗试剂,37℃孵育30 min。然后用DAB显色,以胞内出现棕黄色颗粒为阳性表达。

1.3 计算方法 根据着色程度和区域大小作PPAR-γ半定量分析。着色程度分为4级:强(++)、中(+)、弱(±)和无着色(-)。着色区域也分为4级:0、＜30%、30～60%和＞60% 。以所有着色程度为“++”及染色范围＞30%的癌组织为PPAR-γ高表达,其余为低表达。

采用双盲法随机选取5个视野,在高倍镜(×200)下计数1000个细胞中的 PCNA的阳性细胞数,PCNA指数=阳性细胞数/1 000。

1.4 统计学方法 采用t检验和χ2检验等对数据进行处理。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PPAR-γ在不同组织中的表达 PPAR-γ在大肠癌组织中均有不同程度的表达。在大肠癌病理组织切片中,细胞核周围和细胞浆出现棕黄色颗粒。在癌旁正常大肠组织内的阳性细胞主要是大肠腺细胞,正常大肠组织中的阳性细胞较少,只在零星的大肠腺组织内才可见到。大肠癌组织中的阳性细胞主要是增生或恶变的大肠腺细胞,见图1。癌旁正常黏膜组织的阳性率为21.4%,而大肠癌组织为69.6%,两者有极显著性差异(P＜0.001),见表1。

图1 免疫组织化学示大肠癌PPAR-γ呈阳性,癌旁组织呈阴性(×100)

表1 PPAR-γ在不同组织中的表达(例)

2.2 PPAR-γ的表达与大肠癌病理特点的关系将56例大肠癌病例的切片分别按性别、年龄、肿瘤位置、分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移和Dukes分期进行分组,比较各组中的PPAR-γ表达的差异,见表2。

表2 PPAR-γ的表达与大肠癌病理特点的关系

PPAR-γ临床特点 例数高表达 低表达 P值Dukes分期0.039 A+B 26 14 12 C+D 30 25 5淋巴结转移0.048 N0 22 12 10 N1+ 34 27 7浸润程度0.030 T1+2 21 11 10 T3+4 35 28 7

2.3 PPAR-γ的表达与PCNA-指数显著相关(P＜0.001)。PPAR-γ高表达的大肠癌组织,其PCNA指数亦显著增加 见表3。

表3 PPAR-γ的表达与 PCNA-指数的关系

3 讨 论

Isseman等[2]于1990年首先在老鼠身上发现PPAR。它可以作为许多疾病的治疗靶点,应用于肥胖、Ⅱ型糖尿病、高脂血症、动脉硬化和肿瘤的防治和治疗等。在体内,PPAR与配体结合而被激活后与维甲酸类受体X(RXR)或糖皮质激素受体形成异二聚体 ,再与位于其上游的特异性DNA序列结合使靶基因活化,从而发挥其转录调控的作用。PPAR还可通过干扰核因子κB(NF-κB),通过辅助因子的抑制作用以及影响蛋白质间的相互作用干扰某些信号转导的功能。PPAR存在 3个亚型(α、β和γ),其中PPAR-γ主要分布于脂肪组织、胃肠道及造血干细胞中,参与脂肪的形成和代谢、炎性反应、细胞的分化和凋亡等生理或病理过程。PPAR-γ作为前列腺素和脂肪酸下游的转录介质,其激活可增加大肠中β-catenin的浓度,后者与肿瘤的形成及转移有关[3]。

配体活化的PPAR-γ能抑制细胞生长、促进细胞分化。Altiod等[4]认为PPAR-γ通过下调PPA蛋白激酶,抑制细胞生长转录促进因子E-F/DP而发挥作用。Schaefer等[5]则认为PPAR-γ抑制剂可下调微管蛋白水平,从而抑制细胞周期循环及其凋亡,并促进大肠癌细胞分化。PPAR-γ能调节细胞增殖和炎性反应。Su等[6]发现结肠癌上皮细胞高表达PPAR-γ蛋白。本研究显示 ,大肠癌组织中PPAR-γ的阳性率显著高于癌旁正常黏膜组织,提示PPAR-γ的高表达可能是大肠癌发生的分子标志。这与钟芸诗等[7]的研究结果相一致。他们证实,PPAR-γ在人胰腺癌组织中表达上调 ,可能与胰腺癌的发生有关。本研究证实PPAR-γ的表达在大肠癌Dukes分期的“C+D”期显著高于“A+B”期,且随着病程的进展,PPAR-γ的表达进一步增高,其分化程度越低、恶性程度越高则PPAR-γ的表达就越高、越易被检出,从而有可能为临床疗效观察、病情检测和预后判断提供一个新的指标。穿透浆膜层癌肿组织的PPAR-γ阳性率高于未穿透浆膜层者;在有淋巴结及肝转移癌肿组织的PPAR-γ表达亦显著高于相应无转移者。说明 PPAR-γ的高表达不仅与大肠癌的发生相关 ,还与癌肿的浸润、转移有关 ,同时也预示了患者的不良预后。

有流行病学资料显示进食高脂肪食物与结肠癌发病有关,而前者正是PPAR-γ的天然激动剂。给与C57BL/6J-APCMin/+鼠曲格列酮和罗格列酮,可分别使结肠癌的发生率增加4.25倍和1.83倍;并且可使肿瘤的体积增大。这与给与 C57BL/6JAPCMin/+鼠高脂饮食后的结果相似,可见高脂饮食可能就是通过PPAR-γ而导致结肠癌发生的[8]。

PCNA是一种分子量为33.36 KD的核蛋白,是细胞核合成DNA所必须。PCNA在DAN合成前G1末期升高,S期达到最大值,G2和M 期明显下降。本研究结果显示PPAR-γ高表达组的PCNA指数显著高于低表达组,说明PPAR-γ促进了大肠肿瘤细胞的增殖。而肿瘤细胞的增殖是其浸润转移的基本条件,这也证实PPAR-γ确实与大肠癌的浸润、转移有关。

1 Berthiaume M,Sell H,Lalonde J,et al.Actions of PPAR gamma agonism on adiposetissue remodeling,insulin sensitivity,and lipemia in absence of glucocorticoids[J].Am J Phy siol Regul Integr Comp Physiol,2004,287(5):1116-1123.

2 Isseman I,Green S.Activation a member of the steroid hormone receptor superfamily by peroxisome proliferators[J].Nature,1990,347:645-650.

3 Theodoropoulos G,Papaconstantinou I,Felek ouras E,et al.Relation between common polymorphismsin genes related to inflammatory response and colorectal cancer[J].World J Gastroenterol.2006,12(31):5037-5043.

4 Altiod S,Xu M,Spiegelman BM.PPARγinduces cell cycle withdrawal:inhibition of E2F/DP DNA-binding activity via down-regulation of PP2A[J].Genes Dev,1997,11(15):1987-1998.

5 Schaefer KL,Takahashi H,Morales VM,et al.PPARgamma inhibitors reduce tubulin protein levels by a PPARgamma,PPARdelta and proteasome-independent mechanism,resulting in cell cycle arrest,poptosis and reduced metastasis of colorectal carcinoma cells[J].Int J Cancer,2007,120(3):702-713.

6 Su CG,Wen X,Bailey ST,et al.A novel therapy for colitis utilizing PPAR-gamma ligands to inhibit theepithelial inflammatory response[J].J Clin Invest,1999,104(4):383-389.

7 钟芸诗,姚礼庆,孙益红.过氧化物酶体增殖因子活化受体δ(PPARδ)在大肠腺癌、癌中的表达及其意义[J].中国临床医学,2004,11(6):1040-1042.

8 Saez E,Tontonoz P,Nelson MC,et al.Activators of the nuclear receptor PPARgamma enhance colon polyp formation[J].Nat Med,1998,4():1058-1061.