瘦素在人非小细胞肺癌中的表达及其与肿瘤血管生成的关系

郭水根 储德节 鲍文华 刘 颜 胡志雄 孙书明

(1.复旦大学附属金山医院呼吸内科,上海 200540;2.佳木斯大学第一附属医院呼吸内科,黑龙江佳木斯 154002;3.黑龙江省佳木斯市肿瘤(结核)医院病理科,黑龙江佳木斯 154002)

在与肿瘤相关的死因中,肺癌居于首位,其中75%～80%是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。瘦素(leptin)是一种蛋白质激素。Bouloumie等[1]发现瘦素可以作为一种促血管生成因子,刺激形成新生血管,瘦素具有和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)一样的促进血管内皮细胞增殖的效应。本研究采用免疫组织化学的方法检测NSCLC组织及其癌旁正常肺组织中瘦素和VEGF的表达,对两者与肿瘤血管生成及与NSCLC生物学行为的关系进行初步研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2002年7月—2005年9月在黑龙江省佳木斯市肿瘤(结核)医院接受手术治疗的60例NSCLC患者的石蜡标本,各例患者术前均未行放化疗,并且排除糖尿病及其他代谢性疾病,术后标本均经病理检查确诊。其中男性42例;女性18例;年龄31～72岁,中位年龄 57.0岁;鳞癌 22例,腺癌38例;高分化 15例,中分化24例,低分化21例。有淋巴结转移48例,无淋巴结转移12例;依据美国联合癌症分类委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)2002年制订的 TNM分期标准分期:I期12例,II期30例,III期18例。同时取10例同期肺癌手术患者距癌旁5 cm以上的肺组织作石蜡标本,病理检查证实为正常肺组织。所有石蜡标本作4μm厚度连续切片10张,其中1张行HE染色,复核病理诊断;另9张行免疫组织化学研究。

1.2 试剂与方法 采用链霉素抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶法(SP法),对病理组织进行免疫组织化学染色。组织切片常规脱蜡至水,0.3%H 2O2液封闭内源性过氧化物酶活性10 min,阻断内源性过氧化物酶的活性,微波抗原修复和封闭,SP法染色,DAB显色。瘦素兔抗人多克隆抗体和VEGF兔抗人多克隆抗体工作液浓度均为1:100。用已知阳性片作阳性对照 ,用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定 Leptin阳性细胞为细胞质染成棕黄色颗粒,VEGF阳性判断标准:胞浆内可见染成棕黄色颗粒的细胞。阳性强度判断:参照 Gatalica等[2]的半定量方法将染色强度与阳性细胞百分数分为4级:阴性(0级),为无显色;弱阳性(1级),为＜20%癌细胞阳性或染色呈浅黄色;中等阳性(2级),为20%～50%癌细胞阳性或染色呈黄色;强阳性(3级),为＞50%癌细胞阳性或染色呈棕黄色。每张切片随机选10个不重复的高倍视野,每个视野中计100个目标细胞中阳性表达的细胞数,取其均值作为阳性表达率。

1.4 统计学处理 用SPSS10.0统计软件包进行数据分析。两组率的比较采用 χ2检验;应用Spearman等级相关回归法分析leptin与VEGF指标间的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Leptin在NSCLC、正常肺组织中的表达 60例NSCLC标本中,leptin阳性者有41例(68.30%),其中强阳性15例(36.59%),中等阳性19例(46.34%),弱阳性7例(17.07%);而在正常肺组织细胞中仅有3例(30.00%)leptin呈弱阳性表达。NSCLC组织中瘦素表达的阳性率高于正常肺组织,两者有显著差异(χ2=3.879,P=0.049),见图 1、图 2。

2.2 VEGF在NSCLC和正常肺组织中的表达

VEGF主要在肺癌组织中表达,阳性染色主要局限于细胞浆(图3、图4),在切缘区正常肺组织中表达较弱且多为弱阳性。在60例NSCLC组织中有45例VEGF表达阳性(75%),其中强阳性19例(42.22%),中等阳性 18例(40%),弱阳性8例(17.78%);而在正常肺组织10例中有3例阳性表达(30.00%)且无强阳性表达,NSCLC组织中VEGF表达的阳性率高于正常肺组织,两者有显著差异(χ2=6.101,P=0.014),见图 3、图4 。

2.3 Leptin、VEGF在NSCLC组织中的表达与临床病理因素的关系(表1) 从表1中可见,Leptin、VEGF在NSCLC组织中的表达与肿瘤淋巴结转移及肿瘤分化程度都存在相关性,而与肿瘤的病理类型无明显相关。

2.4 NSCLC组织中leptin与VEGF阳性表达之间的关系 用Spearman等级相关统计分析法示leptin与 VEGF表达呈正相关(r=0.970,P＜0.01)。

表 1 Leptin、VEGF表达与肺癌临床病理因素的关系(例)

3 讨 论

在1994年,由Zhang等[3]首次从小鼠和人的脂肪组织中分离并克隆出肥胖基因(ob基因),其编码的多肽产物即leptin,它是一个由167个氨基酸组成的一种有多靶器官、功能广泛的分泌型蛋白质激素,是机体调节身体质量的重要物质。Leptin的主要生理功能有:抑制摄食、增加能量消耗,减轻体质量;调节生长发育,维持正常的生殖功能;调节免疫及炎症;调节神经内分泌,抑制糖皮质激素的分泌,促进生长激素的分泌;保护胃黏膜的完整性;维持正常的血脂代谢等[4]。有研究[5]发现,瘦素与多种肿瘤的发生密切相关,是一种非特异性的肿瘤生长因子,具有抑制肿瘤细胞凋亡,促进其增殖分化,并增加其对基底膜的侵袭能力,还有促血管形成的作用。

本研究结果提示NSCLC组织瘦素的表达率显著高于远离癌块的正常肺组织,故我们推断在肺癌组织中瘦素呈异质性高表达,在正常人肺组织中有微量瘦素表达。

近年研究已发现瘦素与肿瘤的浸润转移有一定的关系。Ishikawa等[6]研究发现,在61例瘦素高表达的乳腺癌患者中21例有远处转移(34%);而在15例瘦素受体阴性或瘦素低表达的乳腺癌患者中无远处转移,前者的生存率低于后者,从而推测瘦素可能以一种自分泌的方式促进乳腺癌的发生及转移。本研究结果也发现有淋巴结转移、临床 TNM分期较晚及肿瘤分化度低的NSCLC患者中瘦素表达高于无淋巴结转移、分期较早及高分化的肺癌患者,而瘦素在NSCLC组织中的表达与肿瘤大小及其病理类型均无相关,提示瘦素可能参与了肺癌的浸润转移过程。我们推测其机制可能为NSCLC以内分泌的形式使瘦素分泌增加,继而上调MMPs的表达有关,而瘦素在体内外均可促进内皮细胞的增殖及诱导其表达MMPs;也有可能瘦素通过促进肿瘤血管形成而影响NSCLC的浸润转移。

VEGF可介导正常的或病理的血管新生,是最重要的促肿瘤血管生成因子之一,在NSCLC中有促肿瘤血管分裂、增殖、迁移及新生血管形成等作用。本研究中75%的NSCLC组织的VEGF染色阳性,且多为阳性或强阳性表达,而周边正常肺组织VEGF染色仅少数为弱阳性,提示NSCLC能分泌VEGF,且与正常肺组织相比分泌异常增加。本研究显示有淋巴结转移的肺癌组织表达的VEGF阳性率更高,VEGF在NSCLC中的表达与肿瘤分化程度有关,提示VEGF在NSCLC的淋巴结转移和肿瘤的分化过程中起着重要的作用。

本研究显示肺癌组织中瘦素的表达与VEGF的表达呈正相关,而瘦素、VEGF均是强烈的促血管生成因子,由于本研究未同时测定微血管密度(MVD),不能直观说明瘦素、VEGF表达与血管生成之间的关系,但是结合以前的报道和本研究结果我们可以推测:一方面,NSCLC中高表达的瘦素有可能上调了VEGF的表达,并通过高表达的VEGF促进了NSCLC中肿瘤血管的生成;另一方面,高表达的瘦素有可能协同VEGF在NSCLC的血管生成中发挥作用。

1 Bouloumie A,Drexler HC,Lafontanm,et al.Leptin,the product of Ob gene,promotes angiogenesis[J].Circ Res,1998,83(10):1059-1066.

2 Gatalica Z,Lele SM,Rampy BA,et al.The expression of fhit protein is related inversely to disease progression in patients with breast carcinoma[J].Cancer,2000,88(6):1378-1383.

3 Zhang Y,Proceca R,Maffei M,et al.Positional cloning of the mouse obese gene and it′shuman homogeny[J].Nature,1994,372(1):425-432.

4 施劲东,邓星奇,李善群,等.血清瘦素肿瘤坏死因子和甲状腺激素在慢性阻塞性肺疾病患者营养不良发生中的意义[J].中国临床医学,2008,15(4):489-492.

5 Cao R,Brakenhiclm E,Wahlested t C,et al.Lep tin induces vascular permeability and synergistically stimulates angiogenesis with PGF-2 and VEGF[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(11):6390-6395.

6 Ishik awa M,Kitayama J,Nagawa H.Enhanced expression of leptin and leptin receptor(OB-R)in human breast cancer[J].Clin Cancer Res,2004,10(13):4325-4331.