三叶青乙酸乙酯提取物诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡

刘跃银，夏 红

（1.郴州市第二人民医院，湖南 郴州 423000；2.南华大学肿瘤研究所，湖南 衡阳 421001）

三叶青为葡萄科崖爬藤属植物，学名为三叶崖爬藤(Tetrastigma Hemsleyanum Diels et1Gilg)。主要分布于浙江、江西、福建、台湾、湖北、湖南、广东、广西、四川、贵州、云南等省区[1]。三叶青的块根或全草均可入药,具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功效，用于治疗高热惊厥、肺炎、哮喘、肝炎、风湿、月经不调、咽痛、瘰疬等症，具有很好的疗效[2]。药物药理学研究表明三叶青提取物有抗病毒作用和明显的消炎镇痛[3]以及抗肿瘤作用[4]。程伟等[5]在研究三叶青抗肿瘤活性机制时发现：三叶青提取物诱导肺癌A549细胞DNA发生核小体间断裂，DNA琼脂糖凝胶电泳呈现"梯状"条带。本文的研究目的是观察三叶青乙酸乙酯提取物 (ethyl-acetate fraction of extracts from Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg,EAFT)诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡作用，并初步探讨其作用分子机制。

1 材料与方法

1.1 受试物与试剂

三叶青购自湖南医药有限公司(中国长沙)。三叶青提取物参照文献[6]描述的方法，采用乙酸乙酯提取法获得。紫杉醇(TAX)，北京四环医药科技股份有限公司生产，规格：30mg/5mL/支，批号：080830。RPMI-1640培养基 (Invitrogen公司)、小牛血清(Invitrogen公司)、AnnexinⅤ-FITC/PI双染试剂盒 (碧云天公司)细胞死亡ELISA检测试剂盒(罗氏公司)和小鼠抗人Bax和细胞色素C抗体((Santa Cruz Biotechnology公司))购自湖南科泰生物技术有限公司(中国长沙)。

1.2 细胞与细胞培养

人结肠癌HT-29细胞购于中国典型培养物保藏中心 (中国武汉市)，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，加100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素，置于37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 FITC标记Annexin-V/PI双染流式细胞术分析

取经药物或溶媒处理的HT-29细胞1×106，1000g离心5min，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液(1×)和5μL Annexin V-FITC，室温(20～25℃)避光孵育10 min。然后，1000g离心5min，弃上清，加入190μL Annexin V-FITC结合液(1×)和10μL碘化丙啶染色液，混匀，立即用EPICS XL流式细胞仪(美国COULTER公司)检测Annexin V-FITC阳性(早期凋亡)和Annexin V-FITC/PI双染阳性(晚期凋亡)细胞百分率。

1.4 组蛋白/DNA碎片的含量测定

参照细胞死亡ELISA检测试剂盒 (罗氏公司)说明书描述的步骤操作，用EXL-800酶联免疫检测仪，以405nm波长测定吸光度(A)值。

1.5 免疫印迹分析

参照文献[7]描述的方法，目的条带经薄层扫描仪(日本产，型号CS-930)扫描，Alphazmager2200软件测定印迹区带的光密度值。以Bax/β-actin和Cyto C/ β-actin的比值分别代表Bax或Cyto C蛋白表达水平，以DMSO组为1.00。

1.6 统计学分析

实验数据以mean±s表示，应用SPSS15.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。方差具有齐性，用LSD法进行多样本均数之间的两两比较；方差不齐，采用Dunnet T3法进行多样本均数之间的两两比较。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EAFT对HT-29细胞凋亡率的影响

图1可见：EAFT诱导HT-29细胞系Annexin V-FITC阳性(早期凋亡)和Annexin V-FITC/PI双染阳性(晚期凋亡)细胞百分率增高，呈浓度依赖性(P＜0.01)。

AnnexinⅤ-FITC/PI双染FCM分析细胞凋亡率。A：3此独立实验中1次实验的典型图像。B：3次实验的mean±s；与溶媒组比较,**P＜0.01；与溶媒组比较，***P＜0.001；与0.1mg/LEAFT处理组比较,##P＜0.01；与0.1mg/LEAFT处理组比较,###P＜0.001。

2.2 EAFT对HT-29细胞组蛋白/DNA碎片的影响

图2示：EAFT以浓度依赖方式增加HT-29细胞组蛋白/DNA碎片(P＜0.05)。

ELISA法检测细胞组蛋白/DNA碎片水平。3次实验的mean±s；与溶媒组比较,*P＜0.05；与溶媒组比较,***P＜0.001；与#0.1mg/LEAFT处理组比较,###P＜0.05；与0.1mg/LEAFT处理组比较,P＜0.001。

2.3 EAFT对HT-29细胞Bax表达的影响

Western Blotting分析表明：EAFT(10 mg/L)上调HT-29细胞Bax蛋白表达水平，呈时间依赖性 (P＜0.01)。

Western Blot分析全细胞提取物Bax表达水平。图示3次实验中1次实验的典型图像，相对密度(Relative density)为3次实验的mean±s；与溶媒组比较,***P＜0.01；与溶媒组比较,**P＜0.001。

2.4 EAFT对HT-29细胞Cyto C表达的影响

Western Blotting分析证实：10 mg/L EAFT以时间依赖方式增加HT-29细胞Cyto C蛋白表达 (P＜0.05)。

Western Blot分析细胞提取物Cyto c蛋白表达水平。图示1次实验的典型图像，相对密度(Relative density)为3次实验的mean±s；与溶媒组比较,**P＜0.05；与溶媒组比较,*P＜0.01。

3 讨论

众所周知，细胞凋亡早期具有一个重要的特征即位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻至细胞膜外侧。磷脂酰丝氨酸能特异结合膜磷脂蛋白Ⅴ(annexinⅤ)。因此，流式细胞仪检测的单纯AnnexinⅤ-FITC染色阳性细胞为早期凋亡细胞。细胞凋亡的晚期，细胞膜的通透性增高，DNA染料即PI能进入细胞使细胞DNA发出荧光。因此，AnnexinⅤ-FITC/PI双染色阳性的细胞为晚期凋亡细胞。同时，在细胞凋亡的晚期发生细胞基因DNA断裂，形成组蛋白/DNA碎片，因此，细胞组蛋白/DNA碎片水平增高能反映晚期凋亡细胞增加。本文的研究结果首先证明，EAFT具有诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡作用；其主要证据有：1)EAFT以浓度依赖方式增加AnnexinⅤ-FITC染色和 (或)AnnexinⅤ-FITC/PI双染色阳性的HT-29细胞数目；2)EAFT增高HT-29细胞组蛋白/DNA碎片水平。

线粒体在细胞凋亡机制中的作用越来越引起人们的重视。一方面由于线粒体膜间隙的细胞色素C释放至胞质后触发caspase级联，导致细胞死亡；另一方面，线粒体外膜上的Bcl-2蛋白家族调控细胞色素C自线粒体释放，凋亡过程中细胞色素C通过线粒体外膜释放，在ATP/dATP参与下，在胞质中与Apaf-1结合形成寡聚体，Apaf-1通过其氨基端和procaspase-9的功能前区相互作用，导致caspase-9激活，并进一步激活下游的caspase级联反应[8]。而Bcl-2蛋白家族是通过释放细胞色素C执行凋亡指令[9]。本文的Western Blotting分析结果显示，EAFT以时间依赖方式上调HT-29细胞Bax和cyto C蛋白表达水平。说明，EAFT可能通过激活线粒体凋亡诱导途径导致结肠癌HT-29细胞凋亡。

综上所述，我们的结果证实：中国特有植物三叶青的乙酸乙酯提取物 (EAFT)能有效诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡，其作用机制涉及激活线粒体凋亡诱导途径。提升了EAFT作为人结肠癌候选药物的可能性。

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