人支气管上皮细胞β防御素3表达调控的时效性

王曼知，李嘉，王团美

（长沙市中心医院儿科，湖南长沙 410004）

近年来，由于抗生素不合理使用等诸多因素影响致耐药现象日益严重，再加上抗生素研发困难，耗资大，时间长，因此，寻找新型抗生素及其它抗菌物质已成为全球医药界面临的紧迫问题。人防御素具有强大的抗菌功能，是人体天然免疫机制的重要组成部分，是正常机体抵抗外界病原微生物入侵的重要防线，因此人们把它看作一个对付细菌耐药的可能突破口而对其投入了极大的关注。其中，最为引人注目的是人β防御素，它在保护上皮细胞和粘膜免受感染方面起着重要作用[1,2]。与hBD-1在正常人气道中固有、持续表达不同，hBD-3受肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及细菌刺激时可表达上调[3,4]。特别是在呼吸系统感染性疾病中，hBD-3是防御革兰阴性菌、阳性菌及真菌感染的屏障，且相同浓度的hBD-3比hBD-1、hBD-2的抗菌活性高十倍以上，因此，它在防御呼吸道感染中更有价值。国外有学者对hBD-3在呼吸系统中的作用进行了探索[3,4]。但hBD-3的表达是否与刺激时间长短有关，目前国内外报道很少。因此本研究以LPS为刺激物，采用RT-PCR法检测人支气管上皮细胞hBD-3mRNA的表达，观察LPS刺激不同时间后hBD-3表达量的变化，了解hBD-3表达在刺激后何时起效，持续的时间多长，能否成为急性时相反应蛋白应用于临床，为防治呼吸道感染提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人支气管上皮细胞 (购自中南大学湘雅医学院湘雅细胞中心)。

1.1.2 主要试剂 新生牛血清 (FCS)(杭州四季青公司)，1640(美国GIBCO公司)，LPS(E.colio L2880)及琼脂糖(sigma公司),Trizol(invitrogen公司)，RT试剂盒(Fermentas公司)，TAG酶及dNTP(tiangen公司)，二乙基焦碳酸酯 (DEPC)(北京鼎国生物技术公司)，hBD-3引物及阳性对照β-actin引物(上海英骏生物工程技术服务有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

生长良好人支气管上皮细胞随机分为5组，分别为对照组和4个不同浓度LPS组。其中，对照组加入含10%FCS的1640培基5mL，LPS组又分为4组，分别加入含LPS浓度为0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL的10%FCS的1640培基5mL，各组均置于培养箱(37℃,5%CO2)中培养，分别在诱导1h、2h、4h、8h后行RT-PCR检测hBD-3mRNA的表达。

1.2.2 RT-PCR检测hBD-3mRNA的表达

取不同实验组的支气管上皮细胞，分别在LPS诱导1h、2h、4h、8h后采用Trizol法抽提RNA。依吸光度值，取等量总RNA进行逆转录，含1μL随机引物，2μL dNTP，1μLMMLV,总体积20μL。反应条件为：70℃ 5 min，37℃ 5 min，42℃ 60 min,70℃ 10 min。以逆转录产物为模板，采用Tag酶，按以下程序进行PCR反应。上游引物为：5′-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3′，下游引物为：5′-CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA-3′，产物长206bp。反应条件为：98℃预变性5 min，再经94℃变性30 s，58℃退火30s，72℃延伸30 s共32个循环，最后72℃延伸7 min。产物在2%琼脂糖凝胶上电泳。同时设阳性对照β-actin，产物长450bp。

1.3 统计学处理

所有数据用mean±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。数据用SPSS13.0软件进行方差分析，相关分析采用spearman检验，图表绘制采用Excel7.0软件。

2 结果

2.1 细胞培养

生长良好的人支气管上皮细胞镜下显示细胞轮廓清楚，有光泽，易贴壁，生长快，背景干净，脱落细胞少，2～3天即可长满并传代。结果如图1、图2所示。

2.2 LPS刺激LPS刺激后，细胞轮廓不清楚，暗淡无光泽，贴壁细胞易脱落，生长慢，背景模糊。（见图3、图4）。

2.3 hBD-3mRNA在对照组人支气管上皮细胞中的表达发现hBD-3mRNA在对照组人支气管上皮细胞中有微量表达，不同时间组间(1h、2h、4h、8h)无显著性差异(P＞0.05)。（见表1、图5和图6） 2.4 LPS诱导人支气管上皮细胞hBD-3mRNA表达的时效关系

表1 不同浓度LPS不同时间点hBD-3mRNA的表达(mean±s)(n=8)

人支气管上皮细胞在被不同浓度LPS(0.01、0.1、1、10μg/mL)诱导不同时间(1h、2h、4h、8h)后，在同一浓度组随时间增加hBD-3mRNA表达量亦增加，呈时间相关性，不同时间组间比较有显著性差异 (P＜0.01)。hBD-3mRNA表达的半定量结果以hBD-3/β-actin吸光度的相对值计算。（见表1、图7、图8、图9、图10、图11和图12）

3 讨论

支气管上皮细胞覆盖在整个气道，是呼吸道与外界病原菌接触的屏障。细菌感染呼吸道首先要在支气管上皮细胞上粘附、定植，随后产生毒素引起损伤。宿主亦调动自身防御机制，抵抗细菌入侵。宿主的防御机制包括：粘液纤毛系统、吞噬细胞系统、特异性体液免疫系统和先天性防御机制。上皮细胞分泌hBD-3，就是其先天防御机制之一。本实验以人支气管上皮细胞为研究对象，选择多种革兰阴性菌细胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)为诱导物，观察人支气管上皮细胞被LPS诱导后的形态及hBD-3表达强弱的变化，为探索hBD-3能否作为抗菌物质使用从而防治呼吸道细菌感染作基础研究。

实验发现，生长良好的人支气管上皮细胞镜下显示细胞轮廓清楚，有光泽，易贴壁，生长快，背景干净，脱落细胞少，2～3天即可长满并传代。LPS刺激后，细胞轮廓不清楚，暗淡无光泽，贴壁细胞易脱落，生长慢，背景模糊。

本实验中，我们利用不同浓度LPS刺激人支气管上皮细胞后，通过RT-PCR对刺激不同时间后的细胞中hBD-3的表达水平进行了检测。发现在没有LPS刺激下，人支气管上皮细胞中的 hBD-3mRNA有微量表达，不同时间点的hBD-3mRNA表达量没有显著性差异，推测正常人体内支气管上皮细胞中hBD-3有少量表达，不同时间下表达恒定。结果发现，hBD-3mRNA在LPS刺激后1h即表达增加，推测在细菌侵袭呼吸道后，hBD-3在短时间内即可诱导表达，是一个即早应答事件，参与气道最初的防御反应，有望作为急性时相反应蛋白应用于临床。结果还发现，在每一浓度组，随着LPS刺激时间延长hBD-3mRNA表达也随之增强，在一定范围 (1h-8h)内具有时间相关性，表明hBD-3mRNA的诱导表达具有明显的时效关系。并且，当细菌存在时间越长，hBD-3被诱导表达越多。说明细菌感染在诱导hBD-3表达中占据重要地位，一旦机体受到外界病原体入侵时，即可能通过自身防御机制增强hBD-3表达，起到抗感染作用。如细菌感染时间进一步延长，hBD-3mRNA的表达是继续增加，还是在一定时间后衰减，尚不得而知，有望我们进一步研究，为探讨hBD-3治疗的时间窗及药代动力学打下基础。

人有两种免疫应答方式防御病原体入侵：先天和获得性免疫。hBD-3在先天性免疫中主要是通过直接杀伤病原微生物来完成的。它的抗菌作用机制目前还不是十分清楚，大多数人认为，抗菌机理和它在微生物胞膜上形成孔道有关[5，6]。hBD-3还可通过与TLR1和TLR2相互作用，诱导专职抗原递呈细胞分化，从而增强获得性免疫[7]。上调hBD-3可能导致先天性免疫增强，也可能导致获得性免疫增强，产生直接或间接杀伤作用；上调hBD-3亦可能导致获得性免疫反应过激，产生不良后果。因此，随着研究的深入，有望能通过人工调控的方式诱导呼吸道内源性hBD-3的表达，杀灭病原体，使感染在局部得到有效控制达到防治呼吸道细菌感染的目的。对于某些因体内缺乏hBD-3而导致易感性的疾病，如Crohn病[8]，可提供给药的指针。

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