OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

陶晓宇，曾 瑜，段 答，刘 波，赵振宇，滕晓华，卢 明★

（1.湖南师范大学医学院，湖南 长沙410006；2.湖南师范大学第二附属医院，解放军第163医院神经外科，湖南 长沙410003）

脐血又称胎盘血或脐带血，是胎儿出生时脐带和胎盘近胎儿侧血管内的血液。2000年Erice[1]报道脐血中含有大量间充质干细胞祖细胞 (mesenchymalstem cell/mesenchymalprogenitorcell, MSC/MPC)。脐血MSC/MPC与骨髓MSC类似，具有多向分化潜能，可在一定条件下分化为骨细胞、软细胞、肌肉细胞和神经细胞的前体细胞。同时，脐血MSCs具有以下优点：①来源丰富，易于获取；②采集方便，对供者无痛苦；③免疫系统处于原始阶段，移植后免疫排斥反应小；④避免社会伦理和法律问题；⑤具有更强的增殖、分化能力。因此脐血MSC可能成为细胞移植治疗神经系统疾病的一种很好的细胞来源，有着广阔的临床应用前景。本试验利用嗅鞘细胞上清液诱导脐血间充质干细胞,观察其向神经细胞分化的情况，为脐血间充质干细胞移植治疗神经系统损伤提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物与材料

新生SD大鼠(出生第5天)10只(中南大学湘雅医学院动物部)，DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清FBS(Hyclone)，胰蛋白酶和胶原蛋白酶(Gibco)，L-多聚赖氨酸(Sigma)，阿糖胞苷(Ara-c)(Sigma)，兔抗人NSE(Sigma)，鼠单克隆抗体GFAP、小鼠二步法检测试剂盒 (中彬金桥生物工程有限公司)，D-Hank's液和0.01 mol/L PBS均为本实验室配制，离心管和50 mL玻璃培养瓶，解剖显微镜(北京泰克仪器有限公司)，倒置相差显微镜(OLYMPUS)。

1.2 脐血间充质干细胞的分离、培养

脐血取自湖南省妇幼保健医院足月剖宫产的脐带血，均经父母授权同意。无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的脐带血约60 mL，肝素(20 U/mL)抗凝，加等体积无菌磷酸盐缓冲液(PBS)稀释、轻轻摇匀。采用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)：按3:2的比率加入有淋巴细胞分离液的试管中，2500 r/min水平离心25 min(离心半径为16 cm)。试管内液体分为四层，吸取中间的白膜层。加入3～5倍体积的PBS缓冲液稀释，1000r/min离心洗涤10 min后弃上清液，再以同样方法离心洗涤一次。台盼蓝染色、光学显微镜下计数活细胞，用MesenCult培养液调整至1.0× 106/mL的细胞密度用于细胞培养。置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO2培养箱中，24h后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3～5天半量换液一次。待细胞达到80%时，用0.125%的胰酶消化，然后按1:3的比例进行传代接种培养，并记为P1代。传代培养过程中每3天半量换液一次，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，再重复上述操作，传代培养记为P2代，其余类推，传代到P3代。

1.3 大鼠嗅鞘细胞的培养

选用新生1～2天的SD大鼠10只，放入络合碘中浸泡消毒15min，在超净台内显露两侧嗅球，并将之完整取下，置于盛有PBS平衡盐溶液的4℃冰浴的培养皿中,在解剖显微镜下仔细去除嗅球表面的毛细血管和软脑膜，取下纤维层和嗅小球层，用眼科剪剪碎，0.25%的胰蛋白酶 37℃消化 15 min，DMEM(含10%胎牛血清)终止消化，巴氏吸管吹打后用80μm的细胞筛过滤，离心滤液 (1000 r/ min，10 min)，弃上清，DMEM(含10%胎牛血清)重悬细胞，将细胞以5×104/mL接种于无包被的玻璃培养瓶中，培养1h后轻轻振荡培养瓶，吸出未贴壁的细胞悬液重新种植到令一无包被的玻璃培养瓶内，8h后再将未贴壁的细胞悬液接种到用另一个用多聚赖氨酸包被的玻璃培养瓶内，24 h后加入终浓度为2 mg/L的AraC，24 h后全量换液，并用PBS洗一遍，除去AraC的作用，置入37℃，5%CO2培养箱中培养，3天半量换液一次。当细胞数量达到大约80%时吸出上清，加入新鲜培养基(无血清DMEM)。孵育24 h后收集条件培养液。-20℃保存条件培养液。

1.4 诱导分化

分为实验组和对照组。实验组：取P3代MSCs按6×1/mL接种到事先放有多聚赖氨酸包被的盖玻片六空板内，24 h后用OECs无血清上清液培养，2天半量换液一次。对照组：用OECs培养液培养。

1.5 免疫组化鉴定

采用 SABC改良法进行免疫细胞化学检测，取诱导培养后的细胞爬片，4%多聚甲醛固定30min，0.01 mol/L PBS冲洗，加一抗4℃过夜，生物素化二抗室温孵20 min，链酶亲和素-生物素-过氧化酶复合物室温孵育 10 min，DAB显色 3～5min，阴性对照不加一抗，光镜下棕色细胞为阳性。

2 结果

2.1 脐血间充质干细胞的培养和形态学观察

3～4h部分细胞贴壁，24h后大量细胞贴壁，散在分布，呈圆形，3～4d后开始逐渐伸出突起,折光性好,逐渐在局部形成集落生长,以梭形细胞为主，胞浆丰富，核大，细胞平行或呈漩涡状盘旋排列；7～9d以后MSCs迅速扩增,约2～3周后可达80%～90%融合,扩增变缓,即可传代，并依次传至第三代P3(如图1)。

2.2 嗅鞘细胞的培养、观察和免疫组化鉴定

体外培养，OECs呈椭圆形、梭形、三角形，折光性强，突起细长(图2A)，培养第9天p75染色见大量阳性细胞(图2B)。

2.3 细胞形态

实验组培养24h后细细胞体收缩，形成圆形、锥形、三角形，随着诱导培养时间延长，胞质逐渐回缩，呈典型的核周形态，逐渐长出突起，并逐渐变细变长，有的末端发出分支，类似树突、轴突，突起与突起之间连接成网，类似神经元和神经胶质细胞样的形态(图3,4)。诱导后14天用神经元标志物NSE和胶质细胞标志物GFAP鉴定，绝大部分细胞呈染色阳性(图5,6)。

对照组培养后呈多形态(图7)：有破骨样细胞，胞体较大,多个核,圆形,有成纤维样的长梭形细胞,单个核,有较长的突起,折光性强。培养7天后，NSE和GFAP鉴定无阳性细胞。

3 讨论

用于移植治疗中枢神经系统疾病的干细胞来源有胚胎脑组织、骨髓、脐血以及脂肪组织，其中MSCs被认为是良好的干细胞来源。自Sanchez和Buzanska等[2，3]报道了脐血MSCs体外可被诱导表达神经元和神经胶质细胞的标志物，近来，用脐血间充质干细胞作为神经元来源替代凋亡或受损的神经细胞治疗神经系统疾病已经成为研究的热点[4,5]。一些动物实验研究表明人脐血间充质干细胞能改善中风、脊髓损伤、阿尔茨海默病和尼曼病的神经功能以及替代神经干细胞来修复中枢神经系统损伤[6-9]。Ende等[10]证实人脐MSCs移植可明显改善老年痴呆和亨廷顿氏病的症状。目前，多项实验研究发现生长因子、抗氧化剂、神经营养因子、香丹注射液等都有诱导脐血MSCs向神经细胞分化的作用[11-14]，但目前还没有一种十分高效、可行的诱导方法。而且，有报道解释说那些化学试剂诱导表型改变的一个合理解释是一种细胞毒性而不是一种分化[15]。因此，目前如何能在体外培养、扩增脐血间充质干细胞并诱导分化成更多的受限制的神经细胞类型以便在结构和功能上与中枢神经系统受损区整合成为研究的重点。

OECs是一种特殊类型的胶质细胞，多项研究[16,17]发现鉴定了OECs分泌蛋白组中大量与神经生长和再生相关的蛋白，如神经生长因子（NGF）,脑源性神经营养因子 (BDNF),胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)，神经营养素3、4(NT3、NT4),胶质细胞生长因子2(GGF2)和层粘连蛋白(Laminin)等。Wen等[18]利用嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞共培养诱导其分化成神经样细胞，通过nestin、NSE、MAP2、GFAP和P75免疫组化和RT-PCR鉴定鉴定了分化后的神经样细胞，结果证实了骨髓间充质细胞与嗅鞘细胞培养，能有效向神经细胞分化。本试验在此基础上，利用嗅鞘细胞上清液对脐血间充质干细胞进行诱导，获得较高神经元样细胞的分化比例，通过对NSE、GFAP等分子标志物的免疫组织化学分析，发现诱导后的细胞不仅神经样细胞样形态，同时具备和表达及神经细胞标志物。Quirici等[19]认为MSCs的表面存在低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)。生长因子受体都具有酪氨酸酶活性,当生长因子与相应受体结合后，经过一系列的蛋白激酶激活，可以使许多蛋白底物磷酸化,最终引起早期的即刻基因转录，导致基因复制、转录，引起细胞增殖、分化等效应。

本研究通过新生大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导MSCs,通过对NSE、GFAP等分子标志物的免疫组织化学分析,证实了在体外培养条件下,新生大鼠嗅鞘细胞无血清上清液可定向诱导脐血源MSCs向神经样细胞方向分化。但诱导后的神经样细胞的具体分子结构及电生理特性和诱导分化的具体机制有待进一步研究。

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