8-溴-7-甲氧基白杨素诱导白血病Jurkat细胞凋亡

李 凌，阳 云，向红琳，曹建国★

（1.南华大学第一附属医院，湖南 衡阳 421001；2.湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410013）

急性白血病是最常见的儿童恶性疾病，约占所有儿童恶性肿瘤的35%左右[1]。尽管近年来由于免疫学、分子生物学等学科的快速发展，白血病的治疗由以往的单一化疗进展为目前的多种方案综合治疗，如化疗结合免疫治疗、造血干细胞移植、分子靶向治疗等，但目前化疗在白血病的治疗中仍占据着不可替代的重要地位[2]。虽然大部分的病人对于现在的治疗有效，但仍有很高比例病人对治疗不敏感或治疗后复发。因此，发现新的具有诱导白血病细胞凋亡作用的药物是当前的研究前沿领域。

白杨素 (5,7-二羟黄酮，ChR)是一种从多种植物、蜂蜜和蜂胶中提取得到的天然的生物活性黄酮化合物。近年来，ChR的抗肿瘤作用和化疗增敏作用引起了医药研究工作者的极大兴趣。有研究报道指出：ChR通过激活Caspase和灭活Akt诱导白血病U937细胞凋亡[3]；但由于ChR在肠道吸收甚少和5,7-位羟基在体内被迅速糖基化代谢导致活性较低，限制了它的临床应用[4]。8-溴-7-甲氧基白杨素(8-bromo-5-hydroxy-7-methoxychrysin,BrMC)是我们自主设计、合成、筛选得到的一种抗肿瘤作用较白杨素更强的新型白杨素衍生物[5,6]。本文旨在观察BrMC诱导人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

8-溴-7-甲氧基白杨素(BrMC)按照文献[5]的方法由湖南师范大学医学院药物化学教研室合成。三氧化二砷 (Sigmma公司)、RPMI-1640培养基(Invitrogen公司)、小牛血清(Invitrogen公司)、细胞死亡ELISA检测试剂盒(罗氏公司)、二氯荧光素二乙酯(美国Molecular Probes Inc公司)和N-乙酰半胱氨酸(Sigmma公司)购自湖南科泰生物技术有限公司(中国长沙)。AnnexinⅤ-FITC/PI双染试剂盒购自碧云天公司(中国长沙)。

1.2 细胞与细胞培养

人急性T淋巴细胞性白血病Jurkat细胞购于中国典型培养物保藏中心(中国武汉市)，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，加100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素，置于37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 FITC标记Annexin-V/PI双染流式细胞术分析

取经药物或溶媒处理的 Jurkat细胞 1× 106，1000g离心5min，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液(1×)和5μL Annexin V-FITC，室温(20-25℃)避光孵育10min。然后，1000 g离心5min，弃上清，加入190μL Annexin V-FITC结合液(1×)和10μL碘化丙啶染色液，混匀，立即用EPICS-XL流式细胞仪 (美国COULTER公司)检测Annexin VFITC阳性(早期凋亡)和Annexin V-FITC/PI双染阳性(晚期凋亡)细胞百分率。

1.4 组蛋白/DNA碎片的含量测定

参照细胞死亡ELISA检测试剂盒 (罗氏公司)说明书描述的步骤操作，用EXL-800酶联免疫检测仪，以405nm波长测定吸光度(A)值。

1.5 细胞活性氧测定

按照文献[7]的方法，采用DCFH-DA探针FCM检测细胞活性氧生成。收集2.0×106个处理后的Jurkat细胞，无血清培养基清洗三次，重悬于1mL的10μmol/L DCFH-DA探针液中，37℃暗室孵育30min，每隔3～5min颠倒混匀一次，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA后，立即用EPICS-XL型流式细胞仪以488nm为激发波长，525nm为发射波长测定细胞内的荧光强度。

1.6 统计分析

数据以mean±s表示，应用SPSS15.0统计软件进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)。方差具有齐性，用LSD法进行多样本均数之间的两两比较；方差不齐，采用Dunnet T3法进行多样本均数之间的两两比较。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BrMC对Jurkat细胞凋亡率的影响

图1示：BrMC诱导Jurkat细胞系Annexin VFITC阳性(早期凋亡)和Annexin V-FITC/PI双染阳性(晚期凋亡)细胞百分率增高，呈浓度依赖性(P＜0.05)。

图1 BrMC增加Jurkat细胞系Annexin V-FITC阳性细胞百分率

2.2 BrMC对Jurkat细胞组蛋白/DNA碎片的影响

图2表明：BrMC以浓度依赖方式增加Jurkat细胞组蛋白/DNA碎片(P＜0.05)。

经标示浓度受试物处理24 h的Jurkat细胞，ELISA法测定细胞组蛋白/DNA碎片。数据为均数±标准差(n=3)。★P＜0.05;★★P＜0.001;★★★P＜0.001,与溶媒组比较。#P＜0.05;##P＜0.001，与1 μM BrMC处理组比较。

2.3 BrMC对Jurkat细胞活性氧的影响

图3显示：BrMC促进Jurkat细胞活性氧生成，10 mmol/L NAC预孵育能有效阻断BrMC诱导活性氧生成(P＜0.05)。

经标示浓度受试物处理3 h的Jurkat细胞，DCFH-DA标记FCM分析荧光强度(MFI)。数据为均数±标准差(n=3)。★★P＜0.001;★★★P＜0.001,与溶媒组比较。#P＜0.05;##P＜0.01，与10 mM NAC+ BrMC处理组比较。

2.4 NAC对BrMC诱导Jurkat细胞凋亡的影响

图4证明：氧自由基清除剂NAC(10 mmol/L)显著拮抗BrMC诱导Jurkat细胞凋亡率增高和组蛋白/DNA碎片增加作用(P＜0.05)。

经标示浓度受试物处理24 h的Jurkat细胞，A，Annexin V-FITC/PI双染色 FCM 分析；B，ELISA法测定细胞组蛋白/DNA碎片。数据为均数±标准差(n=3)。★P＜0.05;★★P＜0.001;★★★P＜0.001,与溶媒组比较。#P＜0.05，与10 mM NAC+相同浓度BrMC处理组比较。

3 讨论

目前，AML的治疗以化学治疗和骨髓移植为主。采取的具体策略有：⑴抑制肿瘤细胞的增殖；⑵诱导分化；⑶诱导凋亡；⑷免疫疗法和生物治疗；⑸基因治疗[2]。虽然大部分的病人对于现在的治疗有效，但仍有很高比例病人对治疗不敏感或治疗后复发。BrMC是在前期研究中，自主设计、合成、筛选得到的一种抗肿瘤作用较白杨素更强的新型白杨素衍生物[5,6]。本文的主要研究目的是探讨BrMC是否具有诱导白血病Jurkat细胞凋亡作用以及该作用是否涉及BrMC促进活性氧生成。

本文首先检测细胞凋亡早期的重要的生化特征即位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻至细胞膜外侧。结果发现，BrMC以浓度依赖方式增高体外培养Jurkat细胞凋亡率。其二，本文测定细胞凋亡晚期基因DNA断裂，形成组蛋白/DNA碎片。结果进一步证实BrMC增加体外培养Jurkat细胞组蛋白/DNA碎片。以上结果证明，BrMC具有诱导Jurkat细胞凋亡作用，呈浓度依赖性。其三，本文采用DCFH-DA荧光探针标记 FCM分析不同浓度BrMC作用体外培养Jurkat细胞3 h的活性氧水平。结果显示，BrMC能有效促进体外培养Jurkat细胞活性氧生成，同时氧自由基清除剂NAC(10 mM)预孵育完全阻断BrMC诱导Jurkat细胞活性氧生成作用。最后，本文结果还发现10mM NAC预孵育能够部分拮抗BrMC诱导Jurkat细胞凋亡作用；从而说明BrMC促进活性氧生成是其诱导Jurkat细胞凋亡的作用机制之一。因此，本文的结论是BrMC具有诱导Jurkat细胞凋亡作用，且至少部分是通过促进活性氧生成发挥诱导凋亡效应。

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