人工诱骗子的入核分布对核因子-κB活性的调控作用

刘颖勋，权富生，王进科，白学尧

1 西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100

2 东南大学 生物电子学国家重点实验室，南京 210096

核因子-κB (Nuclear factor-κB，NF-κB) 是一类重要的转录因子，参与正常细胞的多种生物学活动。NF-κB的异常活化与肿瘤、炎症、自身免疫以及胚胎畸形发育等众多疾病发生密切相关[1-3]。NF-κB信号转导通路可能成为临床相关疾病基因治疗的一个新的作用靶点。寡核苷酸诱骗子 (ODNs decoy) 是一种能从转录水平对基因表达进行有效调控的新策略[4-5]。寡核苷酸诱骗子调控基因表达的机理是将含有某个转录因子结合位点 (DNA-binding site) 的寡核苷酸导入细胞内，与核内具有DNA结合活性的转录因子结合，削弱转录因子与基因组DNA中其靶点的结合，从而抑制了转录因子对下游靶基因的转录活性。目前，使用脂质体、阳离子多聚物、纳米粒子携带寡核苷酸诱骗子进入细胞的效率已经很高[6-8]。Griesenbach等[9]采用脂质体作载体转导 NF-κB ODNs decoy，认为虽然ODNs很容易被细胞捕获，但由于聚集在细胞质中，并不能有效抑制核内NF-κB的活性及其下游基因的表达。因此，ODNs decoy导入细胞后是否进入细胞核，是其发挥调控转录因子活性的关键[10]。近年来实验证实，核定位信号肽 (Nuclear localization signal，NLS) 能引导蛋白质、DNA、ODNs和化学治疗药物等外源性生物大分子进入细胞核[11-12]。Ludtke等[13]分别构建生物素(Biotin) 修饰的ODNs和亲合素 (Streptavidin) 修饰的NLS多肽，利用biotin-streptavidin特异性结合反应将NLS与不同大小的DNA片段连接起来，通过显微注射将NLS-DNA连接物导入HeLa细胞中，增加了DNA片段的入核效率。Sakaguchi等[14]构建了“谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)-7个精氨酸残基-GAL4 DNA结合域-NLS”组成的转导体系，在功能性蛋白质GST和多肽NLS介导下，携带ODNs穿越细胞质膜，进入细胞核。本研究采用 Sulfo-SMCC 异源双功能交联试剂将末端NH2修饰的诱骗子ODNs和末端巯基修饰 NLS寡肽共价连接，形成NLS-ODNs decoy；以脂质体包埋NLS-ODNs decoy转染HeLa细胞，观察NLS介导的ODNs decoy入核效率，考察NLS-ODNs decoy对核内NF-κB活性的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

宫颈癌HeLa细胞株，购自中国科学院上海细胞研究所。实验所用的NF-κB ODNs decoy和NLS多肽均由上海英俊生物技术有限公司合成，序列及末端修饰见表1。DMEM培养基、TransME脂质体转染试剂为美国 Gibco产品。小牛血清由杭州四季青生物工程技术研究所生产。肿瘤坏死因子 (TNF-α)购自美国Peprotech公司。IllustraTMNICK 核酸纯化柱，美国Amersham公司产品。Sulfo-SMCC交联试剂 (4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester，SMCC) 为美国Sigma公司产品。DNA凝胶回收试剂盒购自QIAGEN公司。

表1 NLS多肽及ODNs的序列及末端修饰Table 1 Sequences and modifications of the NLS peptide and ODNs

1.2 方法

1.2.1 双链寡核苷酸复性

将构成ODNs decoy及EMSA ODNs的两条序列互补寡核苷酸 (见表1) 分别溶解在TEN缓冲液(10 mmol/L Tris·HCl，pH 8.0；1 mmol/L EDTA；100 mmol/L NaCl) 中，再等摩尔混合，95℃水浴5 min，然后缓慢降至室温，形成双链寡核苷酸(ds-ODNs)，4℃保存备用。

1.2.2 NLS-ODNs结合物的制备

复性后的 ODNs decoy与 40倍过量的 Sulfo-SMCC交联试剂 (以二甲基甲酰胺制成 30 mmol/L的储存液) 混合，室温下反应2 h；未反应的SMCC通过Nick核酸纯化柱除去。回收的ONDs decoy与NLS多肽 (以无菌水制成2.5 mmol/L的储存液) 按照1∶10摩尔数比例混匀，室温下反应过夜[13]。反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶，回收纯化NLS-ONDs decoy连接物。纯化产物再次用琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 细胞培养

HeLa细胞用含10% (V/V) 小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 链霉素的DMEM培养液培养，培养箱温度为 37℃，CO2浓度为 5%。当细胞融合度达到 90%后，弃原培养液，再用磷酸盐缓冲液(PBS) 洗涤2次后，0.25%胰酶消化传代继续培养。

1.2.4 NF-κB decoy ODNs转染细胞

转染前24 h，取生长状况良好的HeLa细胞，经胰酶消化制成细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL，每孔200 μL接种于96孔板，CO2培养箱中培养过夜。NF-κB decoy ODNs转染细胞按照TransME 转染试剂使用说明进行，在无菌Eppendorf管中按 1∶25体积比混合 TransME 试剂和无血清DMEM培养液，轻轻吹打混匀，室温下放置15 min；再将TransME混合液加入decoy ODNs溶液至终浓度0.5 μg/μL，室温放置10 min，即可用于细胞转染。细胞随机分成 6组，分别为：不转染对照组、TransME转染组 (无 ODNs)、decoy ODNs转染组(无 TransME)、TransME/decoy ODNs转染组、TransME/NLS-decoy ODNs转染组。

1.2.5 NLS-ODNs连接物对细胞生长的影响

MTT法检测各种转染对细胞生长的影响。细胞转染后24 h更换培养液，每孔加入180 μL无血清DMEM培养液和20 μL MTT (5 mg/mL)，继续培养4 h。轻轻吸除孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO溶解甲瓒盐。用酶标仪读取 570 nm波长吸光度值(OD)。

1.2.6 荧光显微镜观察ODNs细胞内分布

转染 ODNs 24 h后，将细胞用4℃预冷PBS洗涤3次，经4%多聚甲醛固定后用DAPI染色显示细胞核。在荧光显微镜下分别用可见光、绿色光通道(550 nm) 和紫外光通道 (358 nm) 观察细胞并拍照记录。随机选取若干个视野，分别计算ODNs转染细胞和进入细胞核的效率。

1.2.7 HeLa细胞的诱导、核蛋白提取

HeLa细胞转染24 h后，用10 ng/mL的TNF-α诱导 40 min，0.25%胰酶消化并收集各组细胞。以4℃预冷 PBS清洗 2次，将细胞团块重新悬浮于400 μL 4℃预冷溶液A (10 mmol/L HEPES，pH 7.9，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT，0.4 mmol/L PMSF) 中，冰上肿胀15 min，再加入20 μL 10% NP-40，高速振荡10 s，12 000×g离心30 s。弃上清，沉淀重新悬浮于 4℃预冷溶液 B (20 mmol/L HEPES，pH 7.9，420 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L PMSF，25% Glycerol) 中，冰浴振荡 30 min，12 000×g离心15 min。转移上清，Bradford法测定核蛋白浓度。

1.2.8 凝胶电泳迁移率变化分析 (EMSA)

10 μg HeLa细胞核蛋白与生物素 (Biotin) 标记的dsDNA探针 (见表1 EMSA ODNs，EO) 在5倍DNA结合缓冲液 (50 mmol/L Tris·HCl，pH 7.5，250 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L EDTA，15 mmol/L MgCl2，5% Glycerol，2.5 mg/mL BSA，0.25% NP-40，0.25 mmol/L DTT) 中，室温孵育1 h。竞争性实验中，HeLa细胞核蛋白与所需数量的竞争性dsDNA (表1 Competitive ODNs，CO) 及非特异性竞争dsDNA (表1 Nonspecific competitive ODNs，NO)混合，室温孵育 30 min后，再加入生物素标记的dsDNA探针，室温下继续孵育1 h。反应产物上样于6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，100 V电泳2 h。凝胶dsDNA电转印到尼龙膜。尼龙膜经紫外交联、洗涤、封闭处理后，使用过氧化物酶 (HRP) 标记的链霉亲合素 (Streptavidin) 及HRP化学发光底物 (ECL)进行化学发光检测[15]。X-光片显影结果经凝胶成像系统扫描后，分析迁移带积分灰度值。

1.2.9 统计学方法

2 结果

2.1 NLS-ODNs的连接反应

NLS-ODNs连接物纯化前后的电泳结果见图1。ODNs由于共价结合了NLS多肽，分子量增大，改变了其在凝胶中的迁移率。通过DNA凝胶纯化试剂盒回收纯化滞后带，可完全除去游离的ODNs和NLS。

图1 纯化前后的NLS-ODNs连接物的凝胶电泳检测Fig. 1 Gel electrophoresis of the NLS-ODNs ligation products before and after purification. 1: ligation reaction of NLS peptide, decoy ODNs and Sulfo-SMCC; 2: purified NLS-ODNs conjugate.

2.2 NLS-ODNs连接物对细胞生长的影响

以空白组调零后的各组 OD值代表细胞的生长活力。MTT比色实验结果显示 (图2)，与对照组细胞相比，各实验组的细胞生长活力无统计学显著性差异 (P＞0.05)。表明各种转染处理对细胞活力没有显著影响。

图2 各转染组对HeLa细胞活力的影响Fig. 2 Effect of transfection group on HeLa cell viability. N: negative; T: TransME; ND: naked DO; TD: TransME+DO; TND: TransME+NLS-DO.

2.3 NLS-ODNs在细胞内的分布

不同转染组细胞的倒置荧光显微镜观察结果见图3、图4。实验结果表明裸ODNs组直接转染细胞的效率很低 (图 3B，图 4B)，ODNs用脂质体(TransME) 包埋后，转染率显著提高，但进入细胞的ODNs主要分布在细胞质中，而细胞核中的分布不明显 (图3F，图4F)。将ODNs共价连接NLS肽后，再用脂质体包埋转染细胞时，NLS-ODNs大量进入细胞，在细胞质中呈现围核分布，但同时细胞核中也出现明显的分布 (图3J，图4J)。随机选取若干个视野，统计约100个细胞 (表2)，TransME和TransME/NLS-ODNs组细胞转染率分别高达 100%和97.2%，TransME/NLS-ODNs组ODNs进入细胞核的百分率 (17.9%) 显著高于其他两组。结果显示用NLS修饰decoy ODNs可显著提高decoy ODNs进入细胞核的效率。

表2 不同转染方式对ODNs进入HeLa细胞核效率的影响Table 2 Effect of transfection group on rate of ODNs nuclear translocation in HeLa cells

2.4 NF-κB活性的凝胶迁移实验分析

提取未转染处理及各种转染处理细胞的核抽提物 (核蛋白)，用凝胶迁移实验分析核抽提物中NF-κB的活性，电泳EMSA检测结果见图5。图6为3次EMSA检测结果的积分灰度值统计结果。结果显示，NLS修饰的decoy ODNs可显著抑制TNF-α诱导的HeLa细胞核内NF-κB的活性。

3 讨论

图3 各转染组中ODNs转染HeLa细胞24 h后的荧光显微观察Fig. 3 ODNs transfection efficiency on HeLa cells after 24 h. (A-D) Naked ODNs. (E-H) TransME/ODNs. (I-L) TransME/ NLS-ODNs. (A, E, I) Cells under sunlight. (B, F, J) Fluorescence (exciting at 550 nm). (C, G, K) Fluorescence (exciting at 358 nm). (D, H, L) Combination of the Cy3 and DAPI fluorescence.

图4 各转染组中ODNs转染HeLa细胞24 h后的单细胞荧光显微观察Fig. 4 ODNs transfection efficiency on HeLa cells after 24 h with single-cell analysis. (A-D) naked ODNs. (E-H) TransME/ODNs. (I-L) TransME/NLS-ODNs. (A, E, I) Cells under sunlight. (B, F J) Fluorescence (exciting at 550 nm). (C, G, K) Fluorescence (exciting at 358 nm). (D, H, L) Combination of the Cy3 and DAPI fluorescence.

转录因子诱骗子策略是利用人工合成的与转录因子具有高亲和力的寡核苷酸竞争性结合转录因子，使其丧失与内源性基因结合的能力，从转录水平调节基因表达[4,16]。Decoy技术不仅是研究转录调控机理的强有力的工具，同时也为基因治疗的临床应用提供了新的途径[5]。如何将decoy ODNs有效地转运到靶细胞中，尤其是细胞核中，发挥调控作用是 decoy技术的关键问题。研究证实，在载体中加入核定位信号多肽可以明显改善载体的入核效率。本研究采用异源双功能交联试剂 (Sulfo-SMCC) 共价交联末端经氨基修饰的 ODNs和经巯基修饰的NLS寡肽，以脂质体转染 NLS-ODNs连接物进入HeLa细胞，在NLS介导下，提高ODNs进入细胞核的效率，增强其对核转录因子的调控作用。

图5 各转染组对TNF-诱导HeLa细胞核内NF-κB活性调节分析Fig. 5 Effect of transfection group on activity of NF-κB in TNF-α inducing HeLa nucleus. 1: negative; 2−4: nuclear extract (NE) with 10×, 5×, 1× CO, respectively; 5: NE with 5× NO; 6: NE; 7−10: NE from cells transfected with TransME, DO, TransME/DO and TransME/NLS-DO, respectively.

图6 各转染组对TNF-α诱导HeLa细胞核内NF-κB活性调节分析Fig. 6 Effect of transfection group on activity of NF-κB in TNF-α inducing HeLa nucleus. N: negative; T: TransME; ND: naked DO; TD: TransME/DO; TND: TransME/NLS-DO.

Sulfo-SMCC是目前较好的生物大分子交联试剂，由于其拥有 2个反应基团，可以与标记有不同活性基团的生物大分子反应，从而尽可能减少交联中不期望的同源多聚体或自身交联物的形成[17]。同时，细胞活力的MTT测定结果说明，用于共价连接NLS-ODNs的SMCC对细胞生长未产生显著抑制，因此，SMCC可作为制备NLS-ODNs连接物的良好交联剂。

以往研究者多采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化 NLS-ODNs 连接物[13,18]，本研究尝试利用 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离纯化NLS-ODNs连接物。由于NLS多肽在TBE为电解质的琼脂糖凝胶中不发生迁移 (数据未显示)，因此游离的 NLS和 NLS-ODNs连接物在凝胶中可彻底分离。选用DNA凝胶回收试剂盒，经过简单的胶回收就可以纯化出 NLS-ODNs连接物。

脂质体 TransME转染试剂转染效率高，TransME/ODNs组的ODNs聚集在细胞质，进入细胞核的效率很低，而TransME/NLS-ODNs组的ODNs在核内分布明显。但同时TransME/NLS-ODNs组在细胞质中存在着较多的分布，其原因可能是NLS-ODNs连接物包裹在脂质体中，未被核转运因子(Importin α) 识别[19]。如何进一步提高NLS-ODNs的入核效率，仍是今后需要研究的问题。

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