表达大肠杆菌谷氨酸-1-半醛氨基转移酶对红色荧光报告蛋白尿卟啉原Ⅲ甲基化酶的影响

叶爱华，张宽亮1,，陈宗梅1,，荣亮1,，汪苗1,，范军1,

1 安徽农业大学 省级作物生物学重点实验室，合肥 230036 2 安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036

生物四吡咯分子，如血红素、叶绿素、维生素B12和西罗血红素，合成的共有途径中第一个中间物是5-氨基乙酰丙酸 (5-Aminolevulinic acid，ALA)。在动物、真菌和光合细菌中，ALA由ALA合酶催化；在植物和大部分微生物中，ALA来自谷氨酸的碳骨架。首先合成谷氨酰tRNA，随后，它被还原酶催化生成谷氨酸-1-半醛 (Glutamate-1-semiadhyde，GSA)，谷氨酸-1-半醛氨基转移酶 (GSA aminotransferase，GSAT) 催化GSA分子内转氨合成ALA。从ALA到尿卟啉原Ⅲ是所有生物合成四吡咯分子的共有途径，尿卟啉原Ⅲ的转化有 2个分支反应，一条途径最终合成血红素和叶绿素等卟啉类化合物；另一条途径由尿卟啉原甲基化酶(Uroporphyrinogen Ⅲ methyltransferase ，UPMT) 催化，最终合成西罗血红素和维生素B12等卟吩烷化合物。其中，ALA合成和UPMT催化的反应是四吡咯分子合成关键调节位点[1]。

大肠杆菌GSAT由hemL基因编码，一旦突变导致功能丧失，细菌的生长依赖于体外添加ALA，否则细胞死亡[2]。重组纯化的大肠杆菌 GSAT活性被3-氨基-2,3二羟基苯甲酸抑制[3]。谷氨酰tRNA还原酶是ALA合成的关键酶，受血红素的反馈抑制，它和 GSAT相互作用，调节 ALA合成[4]。聚胞藻Synechococcus GSAT突变蛋白对抑制剂不敏感[5]，其编码基因作为植物转基因的筛选标记[6-7]。

细菌UPMT的基因命名较多，主要有cobA和CysGA等。大肠杆菌重组表达 cobA基因，细胞积累催化产物，菌落在紫外光照射下显示强烈红色荧光[8]，这种特性用于克隆细菌cobA基因以及合成尿卟啉原Ⅲ的基因簇[9-10]。cobA及其下游维生素B12合成基因在大肠杆菌共同表达，用于分析酶活性[11-12]。作为报告基因，cobA用于分析细菌、酵母和哺乳动物细胞中的转录水平[13]，根据插入失活筛选克隆外源基因的重组子[14]，以及分析细菌的基因启动子效应[15]。最近发现，表达cobA基因可以增加大肠杆菌对碲酸盐毒性的抵抗力[16]。

大肠杆菌表达 cobA基因产生的红色荧光存在荧光滞后和均一性差等缺点[14,17]，添加ALA能提高胞内UPMT的活性，缩短荧光滞后时间，提高细胞的荧光强度[16,18]，但是会导致大肠杆菌积累血红素合成的中间物，对照菌落也产生红色荧光[13]，此外，ALA在溶液中不稳定[19]。目前，cobA作为报告基因的影响因子研究报道较少。由于GSAT和UPMT两个都是标记蛋白，分别位于西罗血红素合成的关键调节酶，因此，它们之间的协调作用需要深入研究。

大肠杆菌仅含有血红素和西罗血红素，表达ALA合成相关的酶，增加细胞内 ALA以及尿卟啉原Ⅲ含量[20-21]，但表达GSAT的胞内效应未见报道。此前，笔者发现纯化的玉米UPMT结合其催化的红色荧光产物，而纯化的一些细菌UPMT不结合，表明玉米UPMT更适合作为报告蛋白，用于体外分析[22]。本研究中，将大肠杆菌GSAT和玉米UPMT共同表达，研究GSAT对报告蛋白UPMT的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株和试剂

本研究保存的质粒见表 1，大肠杆菌菌株XL-Blue和 BL21 (DE3) 感受态细胞购自北京全式金生物技术公司，酵母浸出物和胰蛋白胨是英国Oxoid公司产品，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)购自美国 Promega公司，3-氨基-2,3二羟基苯甲酸(Gabaculine)、DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA是美国 Sigma-Aldrich公司产品，Strep-tag抗体和His-tag抗体是美国Novagen公司产品，其他分子生物学试剂为大连宝生物公司生产。

1.1.2 仪器

紫外可见分光光度仪 U-2001和高速冷冻离心机SCR20BC是日本Hitachi公司产品，凝胶成像系统由日本Kodark公司生产，蛋白质电泳和转移装置购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆

CTAB法提取大肠杆菌基因组DNA，以此为模板，扩增 hemL基因，引物见表 1，扩增产物插入pUC-18T 载体，测序。采用同义突变去除hemL基因内Nco I作用序列，PCR扩增，电泳检测扩增产物，用限制性内切酶DpnⅠ消化12 h，除去模板，然后转化大肠杆菌XL-Blue，挑选克隆，测序。PCR扩增玉米upmt基因，产物琼脂糖电泳检测后纯化，用相应的限制性内切酶作用，再纯化。

1.2.2 表达载体构建

构建的载体及命名见表 2。将扩增的玉米 upmt基因插入pET Duet-1质粒第2个顺反子，构建pETU载体；将大肠杆菌hemL基因插入pET-51b质粒，构建p51eG载体；NcoⅠ和Hind Ⅲ酶切p51eG质粒的hemL基因，插入 pETU质粒第 1个顺反子，构建pETeGU载体。

1.2.3 重组菌株诱导表达

不同表达载体转化到大肠杆菌 BL21(DE3)，在LB培养基中加入100 µg/mL的氨苄青霉素，37℃培养12 h，按照1∶200稀释，待菌体浓度生长至OD600约为0.5时，加入IPTG，终浓度为0.4 mmol/L，37℃诱导5 h，6 000×g离心10 min收集菌体，超声破碎，加入裂解缓冲液 (100 mmol/L的Tris-HCl，pH 8.0)，超声破碎，15 000×g离心30 min，弃沉淀，上清液备用。

表1 PCR扩增引物及序列Table 1 PCR primers used in this study

表2 本研究所用载体Table 2 Plasmids used in this study

1.2.4 蛋白分析

蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝G-250方法，以BSA作对照。蛋白 SDS-PAGE分析，分离胶为12.5%，电泳完毕后转移到 PVDF膜，转移效果用丽春红显示，1×TBS/0.2% 戊二醛固定40 min，加10 mL封闭液封闭1 h阻断非特异性结合部位，分别加入10 μL 按1∶2 000稀释的Strep·TagⅡ或者组氨酸标签的单克隆抗体，室温孵育过夜。Western漂洗液漂洗3次，加10 mL封闭液及按1∶2 000稀释的HRP标记第二抗体10 μL，孵育1 h后漂洗3次，加1 mL化学发光剂，置入暗室用X光胶片曝光，然后显影，定影。

1.2.5 重组细胞的荧光色素分析[22]

不同表达载体转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，在LB固体培养基上37℃生长15 h，长紫外光下观察菌落荧光。pETeGU质粒转化大肠杆菌，在1 L LB培养基中诱导表达后，收集菌体，破碎细胞，上清液用DEAE-Sepharose CL-6B (3 cm×3 cm) 吸附，裂解缓冲液冲洗5个柱体积，加入20 mL的洗脱缓冲液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，3 mol/L NaCl) 洗脱，立即进行300~700 nm光谱扫描。

2 结果

2.1 基因扩增及突变

利用NEBcutter V2.0软件预测基因的限制性内切酶作用序列，设计不同引物 (表 1)，分别扩增不同基因。根据Expasy中Translate tool软件分析大肠杆菌hemL基因编码的氨基酸序列，采用同义突变技术去除hemL基因的Nco I序列，引物突变序列不改变大肠杆菌密码子的偏爱性。

利用PCR技术，从大肠杆菌基因组DNA中扩增出hemL基因，约1.3 kb (图 1)，测序结果和公布的序列一致，由于在pET-51b质粒表达的蛋白N端含有Strep·TagⅡ标签，所以表达的GSAT删除第1个Met残基。

以本实验室已构建的含有玉米upmt基因p31S1载体为模板 (表2) 进行PCR扩增，产物约为880 bp (图2)，编码N端组氨酸标签和玉米UPMT的Leu91-Ser363。玉米 UPMT前体含有叶绿体导肽，删除 N端和C端一段氨基酸序列，对其功能影响不大[22]。

图1 大肠杆菌hemL的PCR扩增Fig. 1 Escherchia coli hemL gene obtained by PCR. 1: DL5000 DNA marker; 2: E. coli hemL gene.

图2 玉米upmt基因的PCR扩增Fig. 2 PCR analysis of maize upmt gene encoding Leu91-Ser363 amino acid sequence with His6-tag at N terminus. 1: DL2000 DNA marker; 2: maize upmt gene.

2.2 载体构建

本研究构建数个载体 (表 2) 用于基因克隆和表达。分别把大肠杆菌hemL基因和玉米upmt基因插入pET Duet -1质粒的第1和第2个顺反子，表达重组蛋白分别含有Strep·TagⅡ和组氨酸标签。N端组氨酸标签对大肠杆菌GSAT和玉米UPMT的活性没有影响[4,22]。

2.3 GSAT和UPMT蛋白在大肠杆菌的表达水平

分别转化 pETU质粒和 pETeGU质粒，重组UPMT的表达水平没有显著变化 (图 3)，同时检测发现大肠杆菌GSAT也能高效表达，表明pETDuet-1质粒的2个表达单元中每个启动子对下游基因的表达都起作用。

图3 UPMT和GSAT的可溶性蛋白印迹分析Fig. 3 Western blotting analysis of the soluble UPMT and GSAT. Lane 1 and 2 represented the expression of UPMT extracted from the induced E. coli BL21 (DE3) cells carrying pETU plasmid or pETeGU plasmid. Lane 3 represented the expression of GSAT from the induced cells carrying pETeGU plasmid.

2.4 表达GSAT和UPMT对菌落荧光的影响

将pETU质粒转化大肠杆菌，没有IPTG诱导，菌落不显示红色荧光，但是诱导后菌落显示红色荧光 (表3)。无论重组pUC18质粒中Lac启动子下的细菌cobA基因，还是重组pQE31质粒中T5启动子下的玉米upmt基因，其本底表达导致菌落显示红色荧光[13,22]，表明菌株和质粒的不同启动子导致UPMT的表达存在差异。

含有pETeGU质粒的大肠杆菌依赖UPMT的本底表达，菌落显示红色荧光。诱导后，细胞荧光强度高于转化pETU质粒细胞的强度 (表3)，由于两种重组细胞中UPMT的表达水平接近 (图3)，推测表达GSAT促进ALA的合成，提高细胞内尿卟啉原Ⅲ水平。

表3 转化不同载体的重组大肠杆菌荧光展示Table 3 Fluorescent display from the recombinant E. coli carrying the different plasmid respectively

2.5 GSAT的抑制剂对诱导的重组菌落荧光的影响

添加2 mmol/L的GSAT抑制剂3-氨基-2,3二羟基苯甲酸，表达GSAT和UPMT的重组菌落荧光消失 (图 4)。该抑制剂能穿过大肠杆菌细胞，抑制ALA合成，同时对重组聚胞藻GSAT和橙色绿屈挠菌 Chloroflexus aurantiacus蛋白的表达基本没有影响[5,23]，可能ALA合成被抑制，尿卟啉原Ⅲ的含量降低，导致荧光消失，不加抑制剂的菌落显示强烈红色荧光，表明增强胞内ALA的合成比在体外添加ALA对UPMT的荧光效果好。大肠杆菌hemB-突变体不能合成尿卟啉原Ⅲ，表达UPMT后，菌落不显示红色荧光[24]，表明UPMT的荧光依赖内源底物尿卟啉原Ⅲ的含量。

2.6 重组细胞的荧光物质分析

转化pETeGU质粒的重组细胞呈红色，光谱扫描纯化的上清液，显示在354 nm和378 nm有2个吸收峰 (图 5)，分别是三甲基咕啉和西罗双氢叶绿三酸的特异光吸收，是重组UPMT催化产生的主要荧光物质[8]，这和表达玉米UPMT的结果一致[22]。体外添加 ALA能增加血红素合成中间物卟啉原的含量，它们容易氧化产生尿卟啉和粪卟啉等化合物，在405 nm有吸收峰[21]，本研究并未检测到，可能是重组GSAT对提高ALA合成的能力有限，以及重组表达UPMT导致大肠杆菌尿卟啉原Ⅲ的代谢流向发生改变。

图4 浓度为2 mmol/L的3-氨基-2,3二羟基苯甲酸对诱导含有pETeGU质粒的大肠杆菌菌落荧光的影响Fig. 4 The effect of gabaculine at the concentration of 2 mmol/L on the red fluorescence from the induced colonies harboring pETeGU plasmid on LB agar plate upon UV light illumination.

图5 转化不同质粒的大肠杆菌诱导细胞破碎上清液的光谱扫描，图上标注为转化的质粒名称Fig. 5 UV-visible spectra of the extracts from the induced E. coli cells carrying the different plasmids (denoted on the figure). The specific absorption at 354 nm and 378 nm represent trimethylpyrrocophin and sirohydrochlorin respectively.

3 讨论

本研究中，我们选择了具有双顺反子的载体，每个顺反子都有自己独立的启动子和核糖体结合位点，选择表达的蛋白标签序列较短，避免抑制酶活性，便于检测。由于GSAT活性测定误差较大[25]；以及尿卟啉原Ⅲ和UPMT的催化产物难以区分[24]，我们没有分析重组 GSAT的比活和胞内尿卟啉原Ⅲ的含量。

UPMT作为指示蛋白，从理论上推测，其荧光强度可能与蛋白表达水平、内源底物浓度、荧光产物的稳定性以及表达系统有关[13]，表达UPMT导致代谢流向改变，可能降低大肠杆菌血红素含量，解除了它对谷氨酰 tRNA还原酶的反馈抑制[14]。本研究中，表达大肠杆菌GSAT，可能提高ALA合成能力，ALA被大肠杆菌基因组编码的合成血红素一些酶转化成尿卟啉原Ⅲ[21]，它被重组表达的UPMT催化，从而提高转化细胞的荧光强度。

血红素合成的一些卟啉类中间物，例如尿卟啉原Ⅲ，可以作为治疗癌症的药物[21]。大肠杆菌高效合成尿卟啉原Ⅲ，需要重组表达 4个酶，不同蛋白的表达水平差异导致细胞的尿卟啉原Ⅲ浓度不同，需要重组细菌长时间培养和HPLC技术分析才能确定[21]，已发现，体外添加ALA浓度和大肠杆菌表达UPMT产生的荧光强度成正相关[15]，UPMT能否检测细胞内尿卟啉原Ⅲ的含量，有待进一步研究。

植物质体转化中，氨基糖苷-3′-腺苷酸转移酶的 aadA基因和绿色荧光蛋白的基因位于一个双顺反子，作为双功能标记用于转基因后代的筛选和检测[26]。甜菜碱醛脱氢酶基因不仅作为质体转化筛选标记，还提高转基因植物的抗旱性[27]。植物在叶绿体中不但合成四吡咯分子，而且合成类胡萝卜素。研究发现，转基因玉米的类胡萝卜素含量随着转化基因数目增加而升高[28]。西罗血红素作为植物亚硝酸还原酶和亚硫酸还原酶的辅基，参与植物氮和硫的同化，亚硝酸盐诱导玉米幼苗中 upmt基因的表达[29]。GSAT和UPMT作为西罗血红素合成2个关键蛋白，它们的编码基因能否在转基因植株中作为标记并增加西罗血红素的产量，正在深入研究。

REFERENCES

[1] Warren MJ, Bolt E, Woodcock SC. 5-Aminolaevulinic acid synthase and uroporphyrinogen methylase: two key control enzymes of tetrapyrrole biosynthesis and modification. Ciba Found Symp, 1994, 180: 26−40.

[2] Wang LY, Brown L, Elliott M, et al. Regulation of heme biosynthesis in Salmonella typhimurium: activity of glutamyl-tRNA reductase (HemA) is greatly elevated during heme limitation by a mechanism which increases abundance of the protein. J Bacteriol, 1997, 179(9): 2907−2914.

[3] Ilag LL, Jahn D, Eggertsson G, et al. The Escherichia coli hemL gene encodes glutamate 1-semialdehyde aminotransferase. J Bacteriol, 1991, 173(11): 3408−3413.

[4] Lüer C, Schauer S, Möbius K, et al. Complex formation between glutamyl-tRNA reductase and glutamate-1-semialdehyde 2,1-aminomutase in Escherichia coli during the initial reactions of porphyrin biosynthesis. J Biol Chem, 2005, 280(19): 18568−18572.

[5] Smith MA, Grimm B. Gabaculine resistance of Synechococcus glutamate 1-semialdehyde aminotransferase. Biochemistry, 1992, 31(16): 4122−4127.

[6] Rosellini D, Capomaccio S, Ferradini N, et al. Non-antibiotic, efficient selection for alfalfa genetic engineering. Plant Cell Rep, 2007, 26(7): 1035−1044.

[7] Gough KC, Hawes WS, Kilpatrick J, et al. Cyanobacterial GR6 glutamate-1-semialdehyde aminotransferase: a novel enzyme-based selectable marker for plant transformation. Plant Cell Rep, 2001, 20(4): 296−300.

[8] Warren MJ, Stolowich NJ, Santander PJ, et al. Enzymatic synthesis of dihydrosiro- hydrochlorin (precorrin-2) and of a novel pyrrocorphin by uroporphyrinogen Ⅲ methylase. FEBS Lett, 1990, 261(1): 76−80.

[9] Lan XQ, Sato K, Taguchi G, et al. Characterization of a gene conferring red fluorescence isolated from an environmental DNA library constructed from soil bacteria. Biosci Biotechnol Biochem, 2008, 72(7): 1908−1914.

[10] Anderson PJ, Entsch B, McKay DB. A gene, cobA + hemD, from Selenomonas ruminantium encodes a bifunctional enzyme involved in the synthesis of vitamin B12. Gene, 2001, 281(1/2): 63−70.

[11] Roessner CA, Park JH, Scott AI. Genetic engineering of Escherichia coli for the production of precorrin-3 in vivo and in vitro. Bioorg Med Chem, 1999, 7(10): 2215−2219.

[12] Raux E, Leech HK, Beck R, et al. Identification and functional analysis of enzymes required for precorrin-2 dehydrogenation and metal ion insertion in the biosynthesis of sirohaem and cobalamin in Bacillus megaterium. Biochem J, 2003, 370(2): 505−516.

[13] Wildt S, Deuschle U. CobA, a red fluorescent transcriptional reporter for Escherichia coli, yeast, and mammalian cells. Nat Biotech, 1999, 17(12): 1175−1178.

[14] Roessner CA. Use of CobA and CysGAas red fluorescent indicators. Methods Mol Biol, 2002, 183: 19−30.

[15] Feliciano J, Liu Y, Daunert S. Novel reporter gene in a fluorescent-based whole cell sensing system. Biotechnol Bioeng, 2006, 93(5): 989−997.

[16] Araya MA, Tantaleán JC, Pérez JM, et al. Cloning, purification and characterization of Geobacillus stearothermophilus V uroporphyrinogen-III C-methyltransferase: evaluation of its role in resistance to potassium tellurite in Escherichia coli. Res Microbiol, 2009, 160(2): 125−133.

[17] Chou PL, Ohtsuka M, Minowa T, et al. Reddish Escherichia coli cells caused by overproduction of Bacillus stearothermophilus uroporphyrinogen Ⅲmethylase: cloning, sequencing and expression of the gene. Biosci Biotech Biochem, 1995, 59(10): 1817−1824.

[18] Schubert HL, Raux E, Wilson KS, et al. Common chelatase design in the branched tetrapyrrole pathways of heme and anaerobic cobalamin synthesis. Biochemistry, 1999, 38(33): 10660−10669.

[19] Kaliszewski M, Kwaśny M, Kamiński J, et al. The stability of 5-aminolevulinic acid and its ester derivatives. Acta Pol Pharm, 2004, 61(1): 15−19.

[20] Verderber E, Lucast LJ, Van Dehy JA, et al. Role of the hemA gene product and delta-aminolevulinic acid in regulation of Escherichia coli heme synthesis. J Bacteriol, 1997, 179(14): 4583−4590.

[21] Kwon SJ, de Boer AL, Petri R, et al. High-level production of porphyrins in metabolically engineered Escherichia coli: systematic extension of a pathway assembled from overexpressed genes involved in heme biosynthesis. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(8): 4875−4883.

[22] Fan J, Wang DQ, Liang Z, et al. Maize uroporphyrinogen III methyltransferase: overexpression of the functional gene fragments in Escherichia coli and one-step purification. Protein Expr Purif, 2006, 46(1): 40−46.

[23] Oelze J. Light and oxygen regulation of the synthesis of bacteriochlorophylls a and c in Chloroflexus aurantiacus. J Bacteriol, 1992, 174(15): 5021−5026.

[24] Warren MJ, Bolt EL, Roessner CA, et al. Gene dissection demonstrates that the Escherichia coli cysG gene encodes a multifunctional protein. Biochem J, 1994, 302(3): 837−844.

[25] Pugh CE, Nair SP, Harwood JL, et al. Conditions for the assay of glutamate semialdehyde aminotransferase that overcome the problem of substrate instability. Anal Biochem, 1991, 198(1): 43−46.

[26] Jeong SW, Jeong WJ, Woo JW, et al. Dicistronic expression of the green fluorescent protein and antibiotic resistance genes in the plastid for selection and tracking of plastid-transformed cells in tobacco. Plant Cell Rep, 2004, 22(10): 747−751.

[27] Kumar S, Dhingra A, Daniell H. Plastid-expressed betaine aldehyde dehydrogenase gene in carrot cultured cells, roots, and leaves confers enhanced salt tolerance. Plant Physiol, 2004, 136(1): 2843−2854.

[28] Zhu CF, Naqvi S, Breitenbach J, et al. Combinatorial genetic transformation generates a library of metabolic phenotypes for the carotenoid pathway in maize. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(47): 18232-18237.

[29] Sakakibara H, Takei K, Sugiyama T. Isolation and characterization of a cDNA that encodes maize uroporphyrinogen III methyltransferase, an enzyme involved in the synthesis of siroheme, which is prosthetic group of nitrite reductase. Plant J, 1996, 10(5): 883−892.