猪β防御素2与猪γ干扰素在毕赤酵母中的融合表达及生物学活性比较

张定勇，孙蕾，杨利敏，刘文军

中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室 中国科学院微生物研究所分子病毒中心，北京 100101

抗菌肽通常是由小于 50个氨基酸的氨基酸残基组成的具有重要生物学活性的小分子多肽，是生物先天性免疫的重要组成部分。不同物种的抗菌肽一级结构有相似之处，含有至少 2个正电荷氨基酸以及一定比例的疏水氨基酸[1]。防御素是一类分子量约为4.0~5.0 kDa，含有6个半胱氨酸残基，3对二硫键的阳离子抗菌肽。猪 β-防御素 2 (Porcine Beta-Defensin 2，PBD-2) 是新发现的一种β-防御素，预测其成熟肽有 37个氨基酸，化学合成的 PBD-2活性分析表明其具有广谱抗菌作用[2-4]，但利用基因工程手段对其进行表达还未见报道。γ干扰素是由激活的T细胞和NK细胞产生，具有抗病毒和免疫调节功能的细胞因子。猪γ干扰素 (Porcine interferongamma，PoIFNγ) 全基因为 501个碱基，编码 166个氨基酸，前23个氨基酸为信号肽，后143个氨基酸为成熟多肽，推测含有2个糖基化位点[5-7]。1990年，Dijikmans等首先对PoIFNγ基因进行了研究[8]。迄今为止，PoIFNγ已在不同表达系统中获得了表达。

巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris表达系统是一种重要的外源基因表达系统，迄今为止，已有多种蛋白在该系统中实现了表达[9-10]。融合蛋白 (Fusion protein，FP) 技术通过人工手段有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起，进而表达所需要的蛋白。利用此技术可以构建和表达可能具有多种功能的新型目的蛋白，同时还有可能提高原蛋白的表达量。将抗菌肽单独进行表达后，一般表达量低，纯化困难，而将其串联融合后可显著提高表达量[11-12]，但抗菌肽与其他蛋白融合表达的报道较少。目前已有关于 γ干扰素融合蛋白的报道，一般在融合蛋白中作为免疫佐剂发挥功能[13-14]，但 PoINFγ在毕赤酵母中的表达还未见报道。通过酵母表达系统，如果抗菌肽与干扰素融合后能获得高产量且抑菌抗病毒活性的融合蛋白和高产量的PoINFγ，将具有积极的意义。在此假设的基础上，我们将通过毕赤酵母分泌表达PBD-2-PoINFγ融合蛋白与PoINFγ，并对它们的活性进行分析，同时为大规模生产PoINFγ作好准备。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 载体、菌株、病毒和细胞株

毕赤酵母表达载体pPICZαA和P. pastoris表达菌株X33购自Invitrogen公司；大肠杆菌E. coli DH5α、vesicular stomatitis virus (VSV) 及 Madin-Darby Bovine Kidney Cells (MDBK)均由本实验室保存。

1.1.2 工具酶与主要试剂

限制性内切酶Xho I、Xba I和Sac I，Pfu 聚合酶和T4 DNA 连接酶均购自TaKaRa公司；酵母提取物、蛋白胨和酵母氮源碱购自Oxoid公司；DL5000 DNA marker、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自北京诺派生物科技有限公司；INFγ多克隆抗体和INFγ标准品由本实验室自行制备。

1.2 实验方法

1.2.1 PBD-2-PoIFNγ融合基因与PoIFNγ基因的PCR扩增

根据 Uniprot蛋白数据库中猪 β防御素(Q6R953) 和猪γ干扰素成熟肽 (P17803) 氨基酸序列，利用DNAworks在线软件[15]，根据毕赤酵母密码子偏爱性[16]，自动合成14条引物 (表1)，经基因重叠延伸 PCR (Gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)[17-18]将上述两基因融合，PBD-2置于融合蛋白N端，PoIFNγ置于融合蛋白C端 (图1)。

图1 融合基因序列结构示意图Fig. 1 Sequence structure schematic of PBD-2-PoIFNγ fusion gene.

表1 融合基因引物Table 1 Primers for fusion gene

引物由北京博迈德生物科技有限公司合成，其中在引物P1的5′端引入Xho I限制性酶切位点和α信号肽裂解位点Kex2 (aaaaga)，在引物P14的5′端引入Xba I酶切位点和终止子 (taa)。通过5次PCR反应合成融合基因PBD-2-PoIFNγ。其中第1次PCR反应以P1、P2、P3、P4互为模板引物；第2次PCR反应以P5、P6、P7、P8互为模板引物；第3次PCR反应以P9、P10、P11、P12、P13、P14互为模板引物；第4次PCR反应以第1次和第2次PCR产物为模板，引物为P1和P8；第5次PCR反应以第3次和第4次PCR反应产物为模板，引物为P1和P14。利用融合基因序列，设计2条引物PorF和PorR以合成的融合基因为模板扩增PoIFNγ基因。PCR反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃再延伸10 min。

1.2.2 PBD-2-PoIFNγ融合基因与PoIFNγ基因重组酵母表达载体的构建与鉴定

用 Xho I与 Xba I双酶切融合基因 PBD-2-PoINFγ、PoIFNγ基因和载体pPICZαA，酶切产物经琼脂糖电泳切胶回收后在 16℃连接过夜，分别转化E. coli DH5α感受态细胞；提取质粒，经PCR和双酶切鉴定正确后，送至北京博迈德科技发展有限公司测序。将测序正确的重组表达质粒命名为pPICZαA-PBD- 2-PoIFNγ和pPICZαA-PoIFNγ。

1.2.3 PBD-2-PoIFNγ融合基因与PoIFNγ基因重组表达质粒的线性化和电击转化

用 Sac I单酶切 5~10 μg的 pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ和pPICZαA-PoIFNγ重组表达质粒使之线性化，参照 Easy SelectTMPichia Expression Kit操作说明书将P. pastoris X33制备成感受态细胞，取出90 μL分别与10 μL (500 ng/μL) 线性化的重组表达质粒 pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ及 pPICZαA-PoIFNγ混合，使用Bio-Rad Gene Pulser 电转仪于1.5 kV、25 μF和 200 Ω条件下电转化，立即加入 1 mL (1 mol/L) 冰浴山梨醇。转化的酵母细胞涂布YPDS平板 (ZeocinTM抗性浓度为 100 μg/mL)，30℃培养2~4 d。

1.2.4 PBD-2-PoIFNγ与PoIFNγ高抗性菌株的筛选与鉴定

将在 YPDS平板上长出的 PBD-2-PoIFNγ与PoIFNγ单菌落分别转移到含高浓度ZeocinTM平板上(浓度为800 μg/mL) 进行筛选，将在高抗性平板上长出的菌落接种到5 mL YPD液体培养基 (ZeocinTM抗性浓度为100 μg/mL) 中，30℃培养过夜；提取阳性酵母基因组DNA (TIANGEN)，以原始菌和空白表达载体转化的重组酵母菌基因组作对照，分别以PBD-2-PoIFNγ融合基因与PoIFNγ基因特异性引物，进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性的重组子用于诱导表达。

1.2.5 PBD-2-PoIFNγ与PoIFNγ重组菌株的诱导表达与检测

将PBD-2-PoIFNγ与PoIFNγ高抗阳性重组酵母菌分别按1∶50接种到5 mL BMGY培养基中，30℃培养至 OD600=5~6，菌体离心后重悬于 20 mL BMMY培养基，体积浓度为0.5%的甲醇诱导培养，收集24、48、72 h诱导表达上清液，经TCA法浓缩后用SDS-PAGE初步检测表达结果。

1.2.6 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白与PoIFNγ的初步纯化与鉴定

诱导表达上清液浓缩与脱盐: 收集100 mL诱导表达上清液，分别用20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和 90%饱和度的(NH4)2SO4进行浓度梯度盐析沉淀，4℃放置2 h后12 000 r/min离心 10 min，沉淀产物分别溶于 2 mL 0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 中，SDS-PAGE检测沉淀结果。

Superdex 75TM分子筛层析纯化融合蛋白PBD-2-PoIFNγ与PoIFNγ：综合比较在不同浓度梯度下的沉淀结果，将含蛋白量大且杂蛋白少的沉淀进行透析脱盐处理，然后再用10 kDa超滤浓缩管进行处理，去除小分子杂质，得到500 μL样品。在AKATA系统上用0.5 mL/min 的缓冲液 (0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0) 平衡Superdex 75TM柱，然后以0.2 mL/min上样500 μL，再用同一缓冲液以0.2 mL/min进行洗脱，出现洗脱峰后收集样品，将收集的纯化产物分别进行 SDS-PAGE与 Western blotting检测。Western blotting的一抗为PoIFNγ多抗 (1∶5 000稀释)，二抗为辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG (1∶2 500稀释)。

1.2.7 PBD-2-PoINFγ融合蛋白与PoINFγ的活性检测

琼脂扩散法测定 PBD-2-PoINFγ融合蛋白的抑菌活性：将25 μL处于对数生长期的E. coli DH5α与55℃ LB固体培养基25 mL混匀后铺平板，待其凝固后，用灭菌的打孔器 (直径5 mm) 打孔，滴加100 μL待测的融合蛋白样品，37℃培养过夜。以同体积pPICZαA空载体转化的X33酵母表达蛋白为阴性对照，10 μL Kana (25 μg/mL) 为阳性对照。第2天测量抑菌直径 (抑菌直径=抑菌圈直径−加样孔直径)。

细胞病变抑制法测定 PBD-2-PoINFγ融合蛋白与 PoINFγ的抗病毒活性：以含有 10%小牛血清的MEM培养基在37℃、5% CO2的条件下培养MDBK细胞，传代2次。用完全培养基稀释成每1 mL含2.5×105~3.5×105个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞板中，每孔100 μL，于同上的培养条件下培养5 h。将配制的干扰素标准品、PoINFγ和 PBD-2-PoINFγ样品溶液移入接种MDBK细胞的培养板中，每孔加入100 μL。培养18~24 h，弃去培养板中的上清，加入水泡性口炎病毒 (VSV，−80℃保存)，用含 3%小牛血清的MEM培养基稀释至100 TCID50，每孔100 μL。同样条件下培养24 h，然后进行染色和脱色。用酶标仪在570 nm处测定吸光值。以干扰素标准品为参照，计算PoIFNγ和PBD-2-PoIFNγ的效价。

1.2.8 圆二色谱测定PoIFNγ和pBD-2-PoIFNγ的二级结构

用pH 8.0的20 mmol/L Tris-HCl缓冲液将纯化的 PoIFNγ和 pBD-2-PoIFNγ分别配成浓度为0.2 mg/mL的溶液，在Jasco (J-810) 圆二色谱仪上测CD谱，扫描区域为远紫外190~260 nm，样品池光程为1 mm。

2 结果

2.1 PBD-2-PoIFNγ融合基因与 PoIFNγ基因的PCR扩增

将 PCR扩增后得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，以DNA DL5000 marker为分子质量标准，分别获得了大小约为560 bp和460 bp的扩增带，与预期PBD-2-PoIFNγ融合基因 (图 2A) 与 PoINFγ基因(图2B) 片段大小相符。

图2 PBD-2-PoIFNγ融合基因 (A) 与PoIFNγ基因 (B) PCR扩增结果 (B)Fig. 2 Fusion gene of PBD-2-PoIFNγ (A) and gene of PoIFNγ (B) amplified by PCR. M: DNA DL 5000 marker; 1: fusion gene of PBD-2-PoIFNγ; 2: gene of PoIFNγ.

2.2 PBD-2-PoIFNγ融合基因与PoIFNγ基因重组表达载体的构建与鉴定

将连接产物分别转化E. coli DH5α，提取质粒，用Xho I和Xba I双酶切重组表达质粒，获得了预期目的条带 (图略)。测序结果表明重组表达载体中PBD-2-PoIFNγ融合基因与PoIFNγ基因序列未发现突变碱基，且阅读框正确，表明成功构建含有目的基因的重组酵母表达质粒 pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ与pPICZαA-PoIFNγ。

2.3 PBD-2-PoIFNγ与PoIFNγ阳性重组表达酵母菌株的PCR鉴定

利用 PBD-2-PoIFNγ融合基因特异性引物对(P1和P14) 和PoIFNγ特异性引物对 (PorF和PorR)分别对 ZeocinTM抗性平板筛选出的 PBD-2-PoIFNγ与PoIFNγ酵母菌株进行PCR鉴定。从图3中可以看出，分别扩增出约560 bp (图3A) 和460 bp (图3B) 的片段，均与理论大小相符，表明线性化的pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ与 pPICZαA-PoIFNγ成功与酵母菌X33染色体基因组整合。

图3 PBD-2-PoIFNγ (A) 与PoIFNγ (B) 重组酵母菌株的PCR鉴定Fig. 3 Identification of recombinant yeast of PBD-2-PoIFNγ (A) and PoIFNγ (B) by PCR. M: DNA DL5000 marker; 1: negative control; 2: positive control; 3: positive yeast of PBD-2-PoIFNγ, 560 bp fragment amplified with specific primer; 4: positive control; 5: negative control; 6: positive yeast of PoIFNγ, 460 bp fragment amplified with specific primer.

2.4 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白与 PoIFNγ的诱导表达

将选出的PBD-2-PoIFNγ与PoIFNγ高抗阳性酵母菌株以及阴性对照菌 X33和只转入空载体pPICZαA的阴性对照菌分别在含 0.5%(V/V)甲醇的BMMY培养基中诱导培养后，离心取上清，浓缩后进行 SDS-PAGE电泳。都发现两条明显特异性条带，与理论大小相符，而阴性对照菌和转入空载体的对照菌未见相应条带 (图略)。

2.5 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白与PoIFNγ的初步纯化与鉴定

2.5.1 诱导表达上清的盐析与脱盐

将阳性PBD-2-PorIFNγ重组酵母菌诱导表达上清分别用 20%~90%饱和度(NH4)2SO4沉淀后，用pH 8.0的0.1 mol/L Tris-HCl溶解，SDS-PAGE检测沉淀产物 (图4)。其中在70% (NH4)2SO4浓度时得到的PBD-2-PoIFNγ沉淀量最大，但杂蛋白也较多。而在 50% (NH4)2SO4浓度时得到的 PBD-2-PoIFNγ纯度较高，杂蛋白较少，经透析后可以直接用分子筛进行纯化，得到纯度更高的目的蛋白。而PoIFNγ重组酵母菌的诱导表达上清直接用50% (NH4)2SO4浓度进行沉淀，经相同处理后进行分子筛纯化。

2.5.2 Superdex 75TM分子筛层析纯化PBD-2-PoIFNγ与PoIFNγ

含PBD-2-PoIFNγ或PoIFNγ的浓缩脱盐样品分别经Superdex 75TM分子筛层析处理后，将收集液进行 SDS-PAGE和 Western blotting。图 5 (PBD-2-PoIFNγ) 中主要有2个洗脱峰，第1个峰为杂蛋白峰，第 2个峰为目的蛋白峰。从图6A和图 6B的SDS-PAGE结果中发现2条无法分开的蛋白条带，Western blotting 分析检测也是如此，说明这 2条带都能有效结合PoIFNγ多克隆抗体，据此推测 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白与 PoIFNγ以两种形式存在。

图4 硫酸铵盐析PBD-2-PoIFNγ的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE of PBD-2-PoIFNγ by salting-out lane with ammonium sulphate. M: protein marker; 1–8: 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% (NH4)2SO4.

图5 Superdex 75TM分子筛层析纯化pBD-2-PoIFNγFig. 5 Purification of pBD-2-PoIFNγ by Superdex 75TM size-exclusion chromatography. P1: peaks of other protein; P2: elute peaks of target protein.

图6 纯化的PBD-2-PoIFNγ (A) 与PoIFNγ (B) SDS-PAGE和Western blotting分析Fig. 6 SDS-PAGE (A) and Western blotting (B) analysis of purified PBD-2-PoIFNγ. M: protein marker; 1: sample of PBD-2-PoIFNγ; 2: purified PBD-2-PoIFNγ; 3: identification of purified PBD-2-PoIFNγ by Western blotting; 4: sample of PoIFNγ; 5: purified PoIFNγ; 6: identification of purified PoIFNγ by Western blotting.

2.6 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白与 PoIFNγ的活性检测

细胞病变抑制法实验结果显示测定的 PoIFNγ效价达到 105~106U/mg。阴性对照和经不同浓度梯度的融合蛋白处理的MDBK细胞都出现了病变，而标准INFγ处理过的MDBK细胞并没有发生病变；琼脂孔穴扩散测定结果表明融合蛋白并不能抑制大肠杆菌DH5α，融合蛋白pBD-2-PoIFNγ没有像单独的pBD-2一样具有广谱的抑菌作用。

2.7 圆二色谱测定PBD-2-PoIFNγ与PoIFNγ的二级结构

对纯化的PoIFNγ和pBD-2-PoIFNγ进行圆二色谱测量，测定的 CD谱图利用 Secondary Structure Estimation软件包对其CD谱进行最小二乘法修正计算和拟合 (图7)，表2列出了用圆二色谱法测定的PoIFNγ和pBD-2-PoIFNγ的二级结构含量，从计算结果中可以看到片层和转角含量相差不大，而螺旋和无规则卷曲含量差别较大，可推测是部分螺旋结构变为无规则卷曲影响了 PBD-2-PoIFNγ的抗病毒活性。

表2 PoIFNγ和PBD-2-PoIFNγ蛋白的二级结构比较Table 2 Comparison of the secondary structures of PoIFNγ and PBD-2-PoIFNγ

图7 PoIFNγ和PBD-2-PoIFNγ的CD图谱Fig. 7 CD spectra of PoIFNγ and PBD-2-PoIFNγ.

3 讨论

通常融合基因的拼接大多采用限制性内切酶消化和连接酶处理的方法得到，但是费时费力，非常不方便，而重叠延伸PCR技术能快速获得其他依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的基因产物。该技术成功的关键是重叠互补引物的设计，DNAWORKS程序能根据密码子偏爱性，方便、准确地指导寡核苷酸的设计，能最大限度地减少引物“发夹”结构形成，使体外基因拼接工作更易进行。本实验通过DNAWORKs设计14条引物，根据SOE法原理分 5次 PCR方便地合成了融合蛋白基因PBD-2-PoIFNγ。在融合基因序列基础上，我们扩增出了PoIFNγ基因的序列，并用相同载体和酵母菌实现了PBD-2-PoIFNγ融合蛋白和PoIFNγ的表达。本实验中所使用的P. pastoris菌株X33是野生型，耐受性比较好，在含甲醇的培养基中能快速生长，表达载体pPICZαA含有α-MF信号肽序列，在信号肽序列和目的蛋白序列之间引入Kex2蛋白酶切位点，可以在目的蛋白质分泌到胞外时将信号肽切除[19]。由于酵母分泌表达得到大量的上清液，内含一些杂质，直接进行分离纯化并不方便，通过盐析方法，可以将蛋白质在保持活性的前提下得到浓缩和粗分离。本实验首先通过硫酸铵分级梯度沉淀法，获得了较佳蛋白沉淀量但杂蛋白较少时的饱和硫酸铵浓度，在该浓度下将含有融合蛋白 PBD-2-PoIFNγ和PoIFNγ的上清液进行浓缩，透析脱盐后，经过一次分子筛纯化即可得到纯度较高的蛋白。通过SDS-PAGE和 Western blotting检测发现，无论PBD-2-PoIFNγ融合蛋白还是PoIFNγ都有2条明显的条带，因为PoIFNγ上具有2个糖基化位点，推测这2条带可能是糖基化水平不同造成的。

本实验将纯化后的融合蛋白 PBD-2-PoIFNγ通过细胞病变抑制法和琼脂孔穴扩散法进行了活性分析，实验结果表明融合蛋白没有抗病毒和抑菌效果，但非融合的PoIFNγ具有很好的抗病毒效果。原因分析如下：抗菌肽 N末端有较强的形成两亲α螺旋的趋势，带电荷氨基酸均在螺旋一侧分布；C端有形成疏水螺旋的倾向[1,20]。目前被学界比较认可的抗菌肽作用机制是:首先抗菌肽的多聚体与细胞膜相互吸引使抗菌肽结合到膜上；然后抗菌肽的疏水C端插入膜中，而形成两亲α螺旋的N端留在膜界面上；最后两亲性的α螺旋插入质膜，在质膜上形成较大孔洞，从而使细胞死亡。由于PBD-2是置于融合蛋白N端，而C端连接具较长肽链的PoIFNγ，使其C端不能插入到膜中，从而无法使其N端与细菌表面相互作用而失去活性[21]。通过圆二色谱分析发现，PoIFNγ和pBD-2-PoIFNγ的二级结构中螺旋差别较大，推测可能是部分螺旋结构变为无规则卷曲影响了PBD-2-PoIFNγ的空间结构，进而影响了其抗病毒活性。融合蛋白中的PBD-2和PoIFNγ都带有很强的正电荷，但由于当初设计融合蛋白时并没有用间隔序列进行连接，可能正是因为它们近距离的互斥强电荷影响了融合蛋白的二级结构，进而影响空间结构，使融合蛋白无法以二聚体形式存在，从而造成了融合基因虽在毕赤酵母中得到了正常表达，但无法发挥各自的正常功能。如果通过调换抗菌肽和干扰素的位置，并且在融合蛋白之间加入间隔序列可能会产生有活性的融合蛋白。

本研究通过 SOE PCR合成融合基因 PBD-2-PoIFNγ和PoIFNγ基因，并成功在毕赤酵母中表达出融合蛋白PBD-2-PoIFNγ和PoIFNγ。虽然PBD-2与 PoIFNγ融合后的活性分析表明我们采用的融合方式并不能有效发挥它们之间的协同性，但实验结果为进一步深化对抗菌肽和干扰素融合蛋白研究提供了有益启示，同时获得的有活性的PoIFNγ也为大规模生产打下了基础。

REFERENCES

[1] Hancock RE. Peptide antibiotics. Lancet, 1997, 349(9049): 418−422.

[2] Zhang GL, Ross CR, Blecha F. Porcine antimicrobial peptides: new prospects for ancient molecules of host defense. Vet Res, 2000, 31(3): 277−296.

[3] Veldhuizen EJ, Rijnders M, Claassen EA, et al. Porcine β-defensin 2 displays broad antimicrobial activity against pathogenic intestinal bacteria. Mol Immunol, 2008, 45(2): 386−394.

[4] Veldhuizen EJA, van Dijk A, Tersteeg MHG, et al. Expression of β-defensins pBD-1 and pBD-2 along the small intestinal tract of the pig: lack of upregulation in vivo upon Salmonella typhimurium infection. Mol Immunol, 2007, 44(4): 276−283.

[5] Charley B, McCullough K, Martinod S. Antiviral and antigenic properties of recombinant porcine interferon gamma. Vet Immunol Immunopathol, 1988, 19(2): 95−103.

[6] Schreiber RD, Farrar MA. The biology and biochemistry of interferon-gamma and its receptor. Gastroenterol Japon, 1993, 28(4): 88−94.

[7] Williams JG, Jurkovich GJ, Maier RV. Interferon-γ: a key immunoregulatory lymphokine. J Surg Res, 1993, 54(1): 79−93.

[8] Dijkmans R, Vandenbroeck K, Beuken E, et al. Sequence of the porcine interferon-gamma (IFN-gamma) gene. Nucleic Acids Res, 1990, 18(14): 4259.

[9] Cereghino JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev, 2000, 24(1): 45−66.

[10] Macauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, et al. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast, 2005, 22(4): 249−270.

[11] Zhong ZX, Xu ZN, Peng L, et al. Tandem repeat mhBD2 gene enhance the soluble fusion expression of hBD2 in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 71(5): 661−667.

[12] Tian ZG, Teng D, Yang YL, et al. Multimerization and fusion expression of bovine lactoferricin derivative LfcinB15-W4, 10 in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 75(1): 117−124.

[13] Ding YP, Tan WY, Hu R, et al. Construction of a novel fusion protein harboring mouse interferon γ and epidermal growth factor receptor binding domain and enhancement of its antitumor activity. Sci China C: Life Sci, 1997, 40(3): 293−300.

[14] McCormick AL, Thomas MS, Heath AW. Immunization with an interferon-γ-gp120 fusion protein induces enhanced immune responses to human immunodeficiency virus gp120. J Infect Dis, 2001, 184(11): 1423−1430.

[15] Hoover DM, Lubkowski J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucleic Acids Res, 2002, 30(10): e43.

[16] Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J. Codon bias and heterologous protein expression. Trends Biotechnol, 2004, 22(7): 346−353.

[17] Xiong AS, Yao QH, Peng RH, et al. A simple, rapid, high-fidelity and cost-effective PCR-based two-step DNA synthesis method for long gene sequences. Nucleic Acids Res, 2004, 32(12): e98.

[18] Young L, Dong Q. Two-step total gene synthesis method. Nucleic Acids Res, 2004, 32(7): e59.

[19] Fuller RS, Brake A, Thorner J. Yeast prohormone processing enzyme (KEX2 gene product) is a Ca2+-dependent serine protease. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86(5): 1434−1438.

[20] Powers JPS, Hancock REW. The relationship between peptide structure and antibacterial activity. Peptides, 2003, 24(11): 1681−1691.

[21] Christensen B, Fink J, Merrifield RB, et al. Channel-forming properties of cecropins and related model compounds incorporated into planar lipid membranes. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85(14): 5072−5076.