定量分析诱导山羊体细胞重编程过程中端粒酶的表达变化

张淑金，孟书燕，雷蕾，程祥，王华岩

西北农林科技大学动物医学院 陕西省农业分子生物学重点实验室 陕西省干细胞工程技术研究中心，杨凌 712100

体细胞随着分裂次数的增加端粒不断缩短，从而影响基因组的稳定，最终导致细胞的衰老和死亡。端粒酶 (TERT) 能以其自身 RNA为模板反转录合成端粒的重复序列，延长端粒 (Telomere) 的长度，提高基因组的稳定性，保证细胞的持续增殖能力[1-3]。除一些特别组织 (如睾丸等) 外，成体细胞中TERT的表达水平较低，而在胚胎干细胞中 TERT能始终保持很高的活性。因此，端粒酶的高表达对于维持干细胞自我更新能力和多分化潜能具有重要意义[4]。

2006年科学家发现用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc (OSKM) 4个转录因子，可以将鼠的成纤维细胞诱导成多能干细胞 (Induced pluripotent stem cells，iPS)[5]，其细胞形态和生物学特点与ES细胞相似。在小鼠iPS细胞建系成功后，又有4个科研小组先后报道了人iPS细胞建系[6-9]。最近，猴[10]、大鼠[11-12]和猪[5]的iPS细胞系也已成功建立。iPS细胞的产生为干细胞研究开辟了一条新途径，具有广泛的应用前景。由于 iPS细胞研究刚刚起步，还有许多问题和影响因素有待解决。其中 iPS细胞重编程过程中TERT的活性变化，是值得研究的一个问题。

尽管体细胞重编程在小鼠和人上已经有较深入地研究，但在家畜特别是山羊上的研究还在探索中。另外，山羊体内各种组织细胞中的 TERT表达变化目前也不清楚。本研究利用实时荧光定量PCR技术(Real-time RT-PCR)[15]对关中奶山羊胎儿组织和重编程细胞中端粒酶基因相对表达量进行了检测，探讨iPS细胞形成与端粒酶基因表达之间的对应关系，以及碱性磷酸酶阳性和阴性的重编程细胞端粒酶基因表达水平的差异，以期为山羊 iPS细胞的研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

高糖DMEM、谷氨酰胺、胎牛血清 (FBS)、β-巯基乙醇、非必须氨基酸均购自Gibco，人bFGF购自Millipore，α-奈酚磷酸盐、坚固红TR盐、丝裂霉素 C均购自 Sigma，RNA提取试剂 Trizol购自Invitrogen，反转录试剂盒购自Fermentas。TRET一抗购自Abcam，绿色荧光二抗购自鼎国生物制品有限公司。

MEF培养液为：高糖DMEM+10%新生牛血清(NBS)+100 IU/mL青霉素+0.1 mg/mL链霉素。

山羊重编程细胞培养液为：高糖 DMEM+15% FBS+2 mmol/L谷氨酰胺+0.1 mmol/L非必需氨基酸+0.1 mmol/L β-巯基乙醇+4 ng/mL bFGF+100 IU/mL青霉素+0.1 mg/mL链霉素。

根据山羊Tert mRNA序列 (GenBank Accession No. EU139124.1) 和山羊 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) mRNA 序列 (GenBank Accession No. AF030943)，用Primer Premier 5.0软件设计引物，由北京奥科生物技术有限责任公司合成荧光定量PCR引物 (表1)。

表1 荧光定量PCR扩增引物序列表Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

1.2 方法

1.2.1 关中奶山羊胎儿组织RNA的提取

取胎膜完整的3月龄关中奶山羊胎儿，浸泡在含有双抗的生理盐水中，4℃运回实验室。用生理盐水冲洗山羊胎儿，取胎儿皮肤、睾丸、脑、肌肉、肾、肝、脾、肺等组织，切成1 mm3左右的小块，立即放入装有适量液氮的研钵中迅速研磨成粉末，研磨过程中始终保持研钵内有液氮。然后将组织粉末移入1.5 mL的EP管中，加入1 mL Trizol裂解组织，剧烈振荡30 s，并在室温放置5 min。加入0.2 mL 氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置3 min，4℃、12 000 r/min离心15 min。样品分为3层：上层无色水相，下层粉红色有机相，中间蛋白质膜层。将上清转移至另一新的DEPC处理过的1.5 mL EP管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀后室温放置30 min。4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清，用1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀。4℃、7 500 r/min离心5 min，室温放置10~15 min干燥，加入60 μL DEPC水溶解RNA沉淀，−80℃保存。Trizol法提取组织总RNA，紫外分光光度仪检测 RNA的质量和浓度。所得RNA 260 nm/280 nm介于1.8~2.0之间，符合纯度要求。取 3 μg总 RNA进行逆转录反应，步骤按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 操作说明书进行，逆转录的cDNA置于−20℃保存。

1.2.2 SYBR Green 实时定量PCR

首先对样品进行标定。取待测样品的cDNA分别稀释1、10、100和1 000倍。取不同浓度稀释的样本cDNA 2 μL，分别加入2×SYBR Premix ExTaqTM12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DMSO 1.25 μL，去离子水7.25 μL，总反应体系为25 μL。将不同反应体系置于 96孔 Clear Optical Reaction Plate内，在实时荧光定量 PCR仪 (LineGene9600)上进行PCR扩增，并同时进行荧光定量，检测目的基因和内参基因 (GAPDH) 在不同浓度稀释样本中的扩增情况。反应条件为: 94 ℃ 2 min ，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40个循环。从72℃到94℃每上升0.5℃取1次荧光值。试验证明10倍稀释样品的Ct值在15~30个循环出现。取10倍稀释浓度的样本cDNA 2 μL，加入2×SYBR Premix ExTaqTM12.5 μL，上、下游引物各1 μL (10 μmol/ L)，DMSO 1.25 μL，去离子水7.25 μL，总反应体系25 μL。反应条件为：94℃ 2 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40个循环，从72℃到94℃ 每上升0.5℃取1次荧光值。最后生成溶解曲线，通过溶解曲线确定反应产物的单一性。对细胞进行检测时，细胞RNA样品的制备提取详见1.2.1。山羊胎儿成纤维细胞 (GEF) 为对照；AP+为碱性磷酸酶 (AP) 阳性的原代重编程细胞；14#、25#为传到第4代的重编程细胞；F11#、F12#为传到第16代的重编程细胞。上述4株细胞均为AP阴性。Real-time RT-PCR反应程序和定量分析，同上。每个组织或细胞株取 3组样品进行测定，每组样品设3个重复，用随机携带的图像定量分析软件对数据进行处理。

1.2.3 关中奶山羊皮肤成纤维细胞的原代分离培养

无菌条件下取皮肤1 mm3左右，置于含有双抗的PBS中，反复漂洗直到漂洗液清亮透明为止，转移至培养皿中剪弃脂肪和结缔组织，用镊子将组织块在培养皿上均匀摆置，每小块间距5 mm左右，组织块放置好后，向皿内组织块上滴加少量培养液，放入37℃培养箱中。第2天向皿内再加入少许培养液，以后每3天换1次培养液，每天在倒置相差显微镜下观察，有成纤维细胞游离出后，长到细胞成片时，进行传代培养。

细胞生长曲线测定时，将胎儿成纤维细胞分别以3×104细胞数/孔接种于已铺被0.1%明胶的24孔板内，加入培养液，37℃、5% CO2培养。每 2天换液1次。每24 h分别消化3孔细胞，计数每孔细胞总数，求平均值。细胞接种当天记为第 0天，连续测定 8 d。以培养时间 (d) 为横坐标，细胞数(1×104/mL) 为纵坐标，绘制细胞生长曲线。公式为TD=t×log2/(logNt−logN0)，式中TD为细胞群体倍增时间，t为培养时间，N0为接种后的细胞数，Nt为培养t小时后的细胞数[16]。

胎儿成纤维细胞核型分析时，将处于对数生长期 (第3天) 的GEF细胞，用浓度为0.2 μg/mL秋水仙素处理1.5 h，PBS洗2遍，0.25%的胰酶消化，收集细胞，弃上清，加入预温37℃、0.075 mol/L的KCL低渗液5 mL，37℃水浴作用低渗15~25 min。1 000 r/min离心收集细胞，加入固定液(甲醇与冰醋酸3∶1) 5 mL，室温下作用2 h，1 000 r/min离心收集细胞，2次固定室温作用30 min。1 000 r/min离心收集细胞，加入0.1 mL固定液，轻轻吹打混匀制成悬液。距离载玻片约l m高度，向经过−20℃预冷的玻片滴 2滴细胞悬液，空气中自然干燥。用吉姆萨染色10~20 min后用自来水冲洗。干燥后，在倒置显微镜下观察染色体核型情况。

1.2.4 诱导山羊细胞重编程

取生长旺盛的包装病毒 Phoenix-A细胞按照8×105/mL接种到培养皿内，37℃、5% CO2过夜培养，24 h后，将鼠的 4个转录因子 pMXs-Oct4、 pMXs-Sox2、pMXs-Klf4和pMXs-c-Myc转染病毒包装细胞，6 h后换成含血清体积分数为 10%的培养液，收48 h病毒液，0.45 μm滤膜过滤。将4种病毒液按照1∶1∶1∶1的比例混合，按照4 μg/mL的比例加入polybrene，混合均匀，加到提前1 d按8×104/mL铺好的GEF第1代的细胞中，可进行第2次转染以提高转染效率。为了保证转染效率，病毒的滴度要求达到 1×106~5×106以上，病毒转染的当天为诱导0 d。按照上述方法再攻毒1次。以后每天换 1次培养液，第3天将攻过毒的 GEF细胞按照5×103/mL的比例铺到MEF饲养层上。24 h后换成iPS细胞培养液，以后每天换液1次，诱导12 d左右开始出现细胞克隆，18 d左右用机械法在体视显微镜下挑取克隆，接种到已经铺好MEF饲养层的96孔板上，选20株形态好的克隆编号、扩增、冻存。

对部分克隆细胞进行碱性磷酸酶染色。用40 g/L多聚甲醛溶液室温固定集落10 min，无钙镁PBS冲洗3次，每次间隔10 min。再加入AP染液(0.2 mg/mL α奈酚磷酸盐，1 mg/mL坚固红TR盐，0.1 mol/L Tris-HCl，调节 pH值为 8.6)，作用10~20 min。吸出染色液，用PBS冲洗后，倒置显微镜下观察，阳性细胞为红色，阴性细胞不着色。

1.2.5 对诱导的重编程细胞进行免疫荧光检测

待细胞长到 70%~80%时，4%多聚甲醛室温下固定30 min，PBS洗涤3次，每次3~5 min，0.5% Triton打孔15 min；PBS漂洗2次，每次5 min；加入1% BSA封闭30 min；弃去，此步骤不用洗涤，直接加入1% BSA稀释的一抗Tert，4℃过夜；PBS漂洗3次，每次5 min；加入1% BSA稀释的绿色的荧光二抗，于37℃孵育0.5~1 h；PBS漂洗3次，每次5 min；Leica倒置荧光显微镜下观察照相。

2 结果

2.1 山羊组织中TERT的表达检测

采用Real-time RT-PCR方法，对关中奶山羊不同组织中端粒酶基因表达量进行了测定，结果表明相对表达量最高的是睾丸组织。内胚层的3种组织中肝、脾的 TERT表达量较高，是皮肤组织的 6~7倍，而肺脏的TERT量比其他两种组织要低1倍以上。中胚层的肌肉和肾脏组织中TERT的表达量是皮肤组织的3~5倍。TERT表达量最低的是外胚层的大脑和皮肤组织，端粒酶相对表达量在 1左右(图1)。

图1 Real-time RT-PCR定量分析山羊组织中TERT表达量Fig. 1 Real-Time RT-PCR analysis of TERT expression in goat tissues. The RNA samples were made from Guanzhong milk goat tissues including skin, testis, brain, muscle, kidney, liver, spleen, and lung. The relative expression level was calculated by goat TERT (gTERT) vs internal control GAPDH (n=3).

2.2 山羊胎儿成纤维细胞培养与检测

为了进行体细胞诱导重编程研究，我们首先制备了山羊胎儿成纤维细胞。将山羊皮肤组织块接种后，第 2天可以看到原代胎儿成纤维细胞从组织块周围迁出，逐渐向四周扩散。在倒置显微镜下观察组织块透光性较差，呈现为暗黑色遮光区域 (图2A箭头处)。迁出的细胞界限较清楚，细胞以成纤维样为主，也可见不规则三角形样，细胞核呈类圆形或长椭圆形，细胞排列紧密 (图2A)。以后每隔2天换1次培养液，细胞1周即可长满皿底。

对山羊 GEF细胞生长曲线作了测定，细胞在1~2天的潜伏适应期后，第3天进入对数生长期，第6天进入生长平台期，第8天后便进入衰退期。分离得到的细胞样品不同代次的倍增时间分别为P1代36.2 h，P4代39.8 h (图2B)。这一结果表明原代细胞随着传代次数的增加，其生长活力逐步下降。核型分析表明，GEF染色体核型60条，为雄性xy，可用于细胞诱导实验 (图2C、D)。

2.3 诱导山羊体细胞重编程

诱导山羊体细胞重编程是个缓慢的过程，一般需要 15~20 d以上的培养时间。在攻毒时，取 1~3代生长状态好、细胞活力强、密度适中的GEF作为受体细胞 (图3A)。为加强诱导效率，可对细胞进行二次攻毒。攻毒后3 d，将细胞接到有MEF饲养层的培养皿上，细胞密度在5×103/mL左右 (图3B)。诱导的细胞在10~12 d开始出现克隆集落，周围的细胞逐渐开始聚团，从成纤维细胞时的长梭样形态变为圆形并聚集成集落。初始的克隆集落较小，出现两种形态，扁平状集落和隆起状集落 (图3C)。隆起的克隆逐渐变黑，且细胞结构逐渐不清晰，挑单克隆之后不再继续生长，逐渐死亡。扁平的集落边缘整齐，核质比高，挑单克隆之后可以继续传代培养，且保持基本的细胞形态。持续培养15 d后，克隆集落长大，成圆形或者椭圆形，边缘整齐，核质比较高，挑克隆，进行传代培养 (图3D)。

图2 山羊胎儿成纤维细胞 (GEF) 的培养与鉴定Fig. 2 Culture and characterization of GEF cells. (A) Primary tissue culture of GEF. Arrow indicates the tissue block. (B) The growth curve of GEF at first and fourth passages. (C) The karyotype of GEF. (D) The paired chromosomes of GEF.

图3 山羊GEF细胞诱导为重编程细胞Fig. 3 The experimental outline to induce goat GEFs into the reprogrammed cells. (A) Uninfected GEFs (50×). (B) GEFs infected by retrovirus with OSKM (50×). (C) The reprogrammed cell colonies formed in 12 days after the infection (50×). (D) A goat reprogramming cell colony (50×).

2.4 测定山羊重编程细胞中TERT的表达变化

将 4种转录因子 OSKM导入 GEF细胞 (图4A1)，经过15~20 d诱导，培养皿上出现大量克隆集落，经碱性磷酸酶 (AP) 染色，可见 AP阳性克隆 (图4A2)。对典型的重编程克隆进行挑选和编号，并选出4株克隆进行大量扩增培养，制备RNA样品(图4A3−6)。对上述样品，用Real-time RT-PCR方法定量分析TERT基因的表达变化。检测结果表明，在诱导出的原代AP阳性重编程细胞 (AP+) 中端粒酶的相对表达量最高，是诱导前GEF细胞的65倍(图4B)。而分离传代的4株AP阴性重编程细胞，其端粒酶相对表达量明显比对照组GEF细胞高，但是却显著低于原代 AP阳性重编程细胞 (AP+)。以上结果说明端粒酶基因表达量高低与诱导体细胞重编程的完全程度成正相关，AP阳性重编程细胞端粒酶的表达量较高，而 AP阴性重编程细胞端粒酶的表达量相对较低。

图4 山羊重编程细胞克隆和TERT定量检测Fig. 4 The quantitative analysis of TERT expression level in goat reprogramming cells. (A) Goat reprogramming cell clones. 1: Uninduced GEF cells (GEF); 2: AP+ Clone No. 1; 3: APClone No.14; 4: AP- Clone No. 25; 5: AP- Clone F11; 6: APClone F12. The magnification of images is 50×. (B) Real-Time RT-PCR analysis of TERT expression among the different reprogramming cell clones as described in (A). The relative expression level was calculated by goat TERT (gTERT) vs internal control GAPDH (n=3).

2.5 端粒酶免疫荧光检测

对诱导出的重编程克隆进行扩增、冻存。端粒酶免疫荧光检测，碱性磷酸酶 (AP) 阳性的克隆进行端粒酶免疫荧光检测时呈阳性 (图 5A、B)，AP阴性的克隆端粒酶免疫荧光检测呈阴性 (图5C、D)。

图5 免疫荧光检测山羊重编程细胞中端粒酶的表达Fig. 5 TERT immunofluorescence analysis of the reprogrammed cells. (A, B) The reprogrammed AP+ cell clone. (C, D) The reprogrammed AP- cell clone. (A, C) The phase contract. (B, D) TERT immunofluorescence staining.

3 讨论

在Real-time RT-测定中采用相对定量法通常是以表达恒定的看家基因作为内参照，在目的基因与内参基因扩增效率相同的情况下，可以直接得到目的基因相对于内参基因的定量[17]。本实验中端粒酶基因表达量是以看家基因GAPDH作为参照测定出来的。我们首次对山羊胎儿组织中 TERT基因表达情况进行了检测，结果表明睾丸组织中 TERT的表达量显著高于其他组织。另外，我们还注意到不同胚层来源的组织其 TERT的表达量也存在差异，其表现为 TERT表达量在内胚层组织＞中胚层组织＞外胚层组织。Greenberg 等报道TERT基因在成年鼠的各种组织中有广泛的低水平表达，而在胎鼠中胸腺和肠道组织 TERT的表达水平比其他组织的表达显著要高[18-19]。但是，由于实验技术上的问题，我们未能对山羊胎儿胸腺组织中 TERT的表达作出检测。这一缺陷需要在今后的研究中解决。

2006年，日本科学家报道了利用4种转录因子(OSKM) 将小鼠成纤维细胞转变为诱导多能干细胞(iPS细胞)[5]。在此之后，在人[7]、猴[11]、大鼠[13]、猪[14]等动物也得到了 iPS细胞，说明 iPS技术可以广泛用于建立动物 iPS细胞系，从而弥补缺少大动物ES细胞的缺口。目前，还未见在山羊中得到iPS细胞的相关报道。本研究初步探讨了诱导山羊重编程细胞的诱导方法和培养体系，得到了 AP阳性的山羊重编程细胞。但是我们发现细胞诱导过程中，部分重编程细胞的比率很高，极大阻碍了山羊 iPS细胞建系，因此影响细胞重编程的因素还需要进一步探索。

GEF细胞在导入了外源基因后会明显加快增殖速度，4 d之后会发生明显的形态改变。在诱导过程中发现，受体细胞往往会在ES样克隆出现之前便已长满整个培养皿，这时需要对其进行传代，尽管有报道称诱导过程中传代会影响诱导的效率，但是不及时传代将会导致受体细胞大量死亡。在连续传代过程中，应尽量采用Ⅳ型胶原酶进行细胞消化，这样可以除去传代过程中饲养层的干扰。

外源基因对受体细胞的诱导重编程不局限于同一物种，异源转录因子同样可以诱导受体细胞成为iPS细胞[20]。原因可能由于多能性转录因子在不同物种之间具有很高的保守性，可以调控异种受体细胞基因的表达，从而启动重编程过程。所以试验中用鼠的4个转录因子诱导关中奶山羊胎儿成纤维细胞同样得到了重编程细胞。

在对端粒酶表达活性进行检测的过程中，我们发现经过OSKM诱导后的重编程细胞中的TERT表达明显高于受体成纤维细胞，TERT表达量的高低与诱导细胞重编程的程度有直接关联。AP阳性的重编程细胞 TERT表达量要高于处于部分重编程的细胞(AP阴性)。我们还发现分离得到的重编程细胞克隆随着细胞传代次数的增高，端粒酶的表达活性逐渐减弱。这种现象的出现，可能与内源干细胞转录因子尚未完全活化，而外源导入的4个因子又随传代逐渐沉默有关。进一步揭示TERT的活化与iPS细胞的重编程关系，将有益于提高山羊 iPS细胞的诱导效率和成功建系。

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