山羊角膜缘干细胞荧光蛋白 (Venus) 细胞株的建立及角膜上皮植片构建

殷吉庆，刘文强，刘超，赵贵民，张翊华，刘维帅，华进联，窦忠英，雷安民

1 西北农林科技大学动物医学院 陕西省干细胞工程技术研究中心，杨凌 712100

2 杨凌示范区医院病理科，杨凌 712100

角膜缘干细胞 (LSCs) 是角膜上皮再生和修复的源泉，在眼表重建中起着极为重要的作用[1-3]。1986年，Schermer等[4]首次通过实验证明角膜缘干细胞位于角膜缘基底层“Vogt”栅栏区的乳头状结构中。角膜缘干细胞具有成体干细胞的生物学特性，即慢周期性和高增殖潜能[1,5]，此外，LSCs是角膜上皮组织中体积最小的细胞，这一特征有助于角膜缘干细胞的分离与纯化[6-7]。

角膜上皮增生过程为：角膜缘干细胞 (Limbal Stem Cells，角膜缘基底部最基层)→短暂扩充细胞(Transcient amplifying cell，角膜缘基底部)→有丝分裂后细胞 (Post mitotic cell，角膜上皮大多数非表面区域)→终末分化细胞 (Terminally differentiated cell，角膜浅表上皮细胞)。现认为，角膜上皮的更新是通过垂直向上运动和水平向心运动共同作用实现的，而其再生的最终源泉则是LSCs[8]。

角膜缘干细胞缺陷症 (LSCD) 主要是由先天性疾病引起，后天疾病包括热损伤或化学损伤，Stevens Johnson 综合症等[9-11]。由于角膜缘干细胞的缺失，角膜周边的结膜细胞和血管会向角膜内长入，角膜混浊，致使患者视力下降，严重时会导致角膜盲[12]。

Kenyon等[13]首先将角膜缘干细胞移植应用于临床。近年来，随着人们对角膜缘干细胞研究的不断深入，角膜缘干细胞的移植在临床上的应用逐渐得到推广。1997年，Pellegrini等[14]首次提出角膜缘干细胞体外扩增移植技术，缓解了治疗严重角膜病供体角膜缺乏、免疫排斥、自体移植损伤健眼等问题[15]。

据统计，通过角膜缘干细胞体外移植方法治愈角膜缘干细胞缺陷症成功率可达75%[16]。尽管角膜缘干细胞移植术日见成熟，但术后角膜缘干细胞修复受损机体的作用情况并不明确。弥胜利等[17]通过检测供体细胞 sry基因研究角膜缘干细胞是否长期存在于雌性受体眼表。在人工角膜移植后的2个月，一只受体母羊角膜组织中可检测到sry基因存在；12个月后，尽管病理模型的损伤角膜已经得到修复，但检测不到sry基因存在。这就给我们留下了疑问，即移植到病理模型上的供体角膜缘干细胞究竟是如何对损伤角膜进行修复的？是否存在角膜外周细胞经转分化参与修复，或是外周血中的干细胞通过体内循环参与了角膜的修复。本研究筛选 Venus荧光蛋白标记的山羊角膜缘干细胞并建立转基因细胞株，以其为种子细胞构建人工荧光角膜上皮植片，为后期动态监测供体角膜缘干细胞移行变化提供实验基础。

1 材料

1.1 实验材料

2~12月龄关中奶山羊眼球由杨凌某屠宰场提供。羊膜由杨凌某医院提供。

1.2 质粒

pVenus质粒 (带黄色荧光蛋白) 由英国纽卡斯尔大学分子与细胞研究所惠赠。

1.3 主要试剂

DMEM/F12，Trizol，Opti-DMEM，新霉素(G418)，脂质体LipofectamineTM2000均购自Invitrogen公司；表皮生长因子 (EGF) 购自 peprotech公司；氢化可的松、三甲碘原氨酸、腺氨酸、四型胶原(Collagen IV)、Dispase II酶、胰岛素、胰蛋白酶、二甲基亚砜 (DMSO)、Integrinβ1单克隆抗体均购自Sigma公司；P63单克隆抗体购自Millipore公司；免疫荧光二抗 cy3购自碧云天生物技术公司；胎牛血清 (FBS)、两性霉素B、EDTA购自Hyclone公司；谷氨酰胺购自 Merck公司；噻唑蓝 (MTT) 购自Amersco公司；PrimeScriptTMRT reagent试剂盒购自TaKaRa公司；Golden Easy PCR system、DNA marker购自 Tiangen公司；培养皿、培养板均购自Corning公司。

2 方法

2.1 山羊角膜缘干细胞原代分离与培养

2.1.1 角膜缘组织的取材

在无菌条件下摘除山羊眼球，用含青霉素(100 IU/mL)、链霉素 (100 IU/mL)、两性霉素 B (2.5 µg/mL) 的无钙镁的PBS反复冲洗血污，环形剪取角膜缘外1 mm、角膜缘和角膜缘内2 mm的角膜上皮组织，再将组织剪成若干个1 cm左右组织条，浸洗数次，每次15 min。

2.1.2 角膜缘上皮干细胞富集培养

将角膜缘组织条置于 1.2 IU DispaseII酶中，37℃消化90 min，而后在体视显微镜下，将其上皮层与基底层钝性剥离，并收集角膜缘上皮层，剪碎。用含0.125%胰蛋白酶及0.02% EDTA消化液37℃消化角膜缘上皮5~7 min，以含10%新生牛血清培养液终止消化，吹打、分散细胞。收集的细胞使用Collagen IV 20 min快速粘附法富集角膜缘干细胞[18]。简言之，以5×104个/mL细胞接种于100 µg/mL Collagen IV包被过的培养皿，培养20 min后将培养液移出，加入角膜缘干细胞条件培养液，37℃、5% CO2培养箱中培养，隔日换液。待到细胞生长融合至 70%~80%满皿时传代培养，每次传代使用Collogen IV 20 min粘附富集角膜缘干细胞，在倒置显微镜下观察其生长特性。

2.2 角膜缘干细胞的荧光标记

2.2.1 G418最优浓度筛选试验

将第3代纯化的角膜缘干细胞以1×105个/孔接种在24孔板中，加入含100~800 µg/mL不同浓度的G418的培养液，以100 µg/mL递增，培养10~14 d，每天显微镜观察细胞死亡情况，确定杀死全部角膜干细胞的G418最低浓度为最优浓度。

2.2.2 pVenus质粒转染角膜缘干细胞

将原代角膜缘干细胞20 min Collagen IV快速富集培养，待细胞融合至70%~80%，按LipofectamineTM2000说明书步骤进行转染。转染细胞培养24 h后，以1×104个/mL细胞接种于60 mm培养皿中，待细胞贴壁后换为含 500 μg/mL G418的培养液培养 1个月以杀死未转染细胞。在荧光显微镜下挑取带有绿色荧光的阳性细胞克隆，并扩增培养。

2.3 荧光角膜缘干细胞株的相关检测

2.3.1 荧光角膜缘干细胞生长状态观察

Leica荧光倒置显微镜下观察G418筛选细胞的形态及荧光表达情况。

2.3.2 免疫荧光染色检测

将荧光标记角膜缘干细胞悬液以 5×103个/mL细胞接种于48孔培养板培养5 d后，对G418筛选后的角膜缘上皮干细胞的阳性标记物P63和Integrin β1进行免疫荧光检测。培养细胞先用 PBS漂洗5 min，重复3次，用4%多聚甲醛固定5~10 min，PBS漂洗3次，每次5 min。加入0.2% Trixon-100室温作用10 min，PBS漂洗3次，每次5 min (仅核内表达 P63进行该步骤)。加入封闭液室温作用30 min后，滴加一抗，4℃过夜。PBS漂洗5 min，重复3次。滴加红色荧光二抗体cyc3稀释液，37℃孵育1 h。PBS漂洗5 min，重复3次。使用荧光染料Hoechst 33342染细胞核，荧光倒置显微镜下观察细胞状态及荧光表达情况，照相。以PBS代替单克隆一抗为阴性对照组。

2.3.3 半定量RT-PCR检测

分别提取生长状态良好的第6代转染及未转染角膜缘干细胞总RNA，并于260 nm波长测定其浓度。按PrimeScriptTMRT reagent试剂盒说明书分别取0.5 µg总RNA合成cDNA。为了确保两种不同细胞的基因表达量处于指数期，先以倍比量的cDNA为模板，分别对β-actin、p63、pcna、venus基因进行PCR，分析PCR产物表达量关系，筛选相对基因引物的最佳循环数。简言之，将4 µg/µL cDNA，倍比逐步稀释为2 µg/µL、1 µg/µL、0.5 µg/µL四种浓度，分别取0.2 µL相对应浓度的cDNA为模板，以38个循环次数为起点逐步降低2个循环数，直至基因的 4种表达量也是倍比关系，循环数最多的即最佳循环数。然后以β-actin为内参，按照其相应退火温度及最佳循环数 (表1) 进行PCR，然后取5 µL样品在 2%琼脂糖凝胶上电泳检测，紫外照相系统照相，并分析目的条带的表达量。

2.3.4 生长曲线制作及群体倍增时间测定

将生长状态良好的第 3代转染的角膜缘干细胞，以100个/孔细胞接种于96孔板中，每代细胞接70个孔。从细胞培养第2天起，每24 h检测5孔细胞，每个待测孔加5 mg/mL MTT液20 µL，继续培养4 h，待蓝紫色复合物形成后，吸弃培养液加150 µL DMSO振荡10 min，蓝色颗粒充分溶解后，于酶联免疫检测仪上测定490 nm、650 nm处每孔OD值，每天以未接种细胞孔为空白组。计算均值，共计8个时间点。以培养时间为横轴，每日OD值的平均值为纵轴，绘制生长曲线，以同代未转染细胞为对照。分别在潜伏期后和进入平台期前的一段角膜缘干细胞生长曲线随机取 1个点，并分别标记对应横轴，纵轴上的时间点 (T0) 和OD值，然后在纵轴选定该OD值得2倍数值，并在曲线上选定对应该值的点及相应时间点 (Tt)。细胞群体倍增时间(h) = Tt−T0，共设4个重复。

2.4 荧光角膜上皮植片的构建

2.4.1 羊膜支架的制备

常规制备和保存羊膜[19]。37℃解冻羊膜30 min，PBS反复冲洗。加入0.1% EDTA 37℃消化40 min后，用细胞刮刀刮去羊膜上皮细胞，PBS清洗数次。将处理后羊膜基底面向上平铺于培养皿内，准备好的硝酸纤维素膜附于其上，然后翻转，放入一新皿内，细胞培养箱中孵育30~60 min，待用。

2.4.2 羊膜角膜上皮植片的构建

将GLSC-V以1×106个细胞/mL的浓度，用微量吸管小心滴加到羊膜上皮基底膜上，37℃恒温操作台上静置20 min后，加入少量角膜缘干细胞条件培养液，移入培养箱过夜。第 2天待细胞粘附于羊膜上开始增殖时，再补加适量培养液培养。隔日换液，培养至5~7 d，再降低培养液面[20]，气液交界面继续培养10~15 d，细胞呈复层生长，表面有细胞开始脱落时，停止培养。

2.5 荧光角膜上皮植片的相关检测

2.5.1 生物学观察

Leica倒置荧光显微镜下观察细胞的生长状态及荧光表达情况。

2.5.2 组织结构的观察

将分层角膜上皮植片固定于 4%的多聚甲醛溶液中。石蜡包埋、连续切片、HE染色、封片后在光学显微镜进行组织结构的观察并照相。取正常角膜上皮作为对照。

表1 角膜缘干细胞标记基因的相关信息Table 1 The information of corresponding genes of LSCs

2.5.3 免疫化学检测

常规方法制作荧光角膜缘上皮组织的冰冻切片，以抗角膜缘干细胞P63的单克隆抗体对培养获得的复合上皮组织进行免疫荧光染色，以不加一抗作为阴性对照。

3 结果

3.1 山羊角膜缘干细胞生长特性观察

经Collagen IV 20 min粘附原代山羊角膜缘干细胞贴壁后以圆形居多，48 h后细胞数量明显增多，大约1周后形成大量的片状克隆 (图1A)，克隆团中的细胞以铺路石样的多角形细胞为主，细胞间界限分明，细胞核仁明显且大，常为2~3个 (图1B)。细胞融合连生形成致密细胞单层，如果不传代连续培养，细胞可以聚集生长，形成类似于胚胎干细胞的细胞集落。

图1 山羊角膜缘干细胞形态观察Fig. 1 The morphology of GLSCs. (A) The GLSCs formed holoclone (50×). (B) The GLSCs developed the typical polygon shaped phenotype (200×).

3.2 荧光角膜缘干细胞株的筛选

转染 venus的角膜缘干细胞经 G418最佳浓度(500 μg/mL) 培养液筛选4周。荧光显微镜下观察，培养皿中有若干个带有绿色荧光的细胞克隆。将阳性克隆株在无菌条件下挑取出来，扩增培养。在光镜下观察细胞形态仍以多角形为主。荧光显微镜下观察，荧光蛋白在整个细胞中都表达 (图2A，2B)。

3.3 荧光角膜缘干细胞株的生物学特性检测

3.3.1 免疫荧光检测

GLSC-V在荧光镜下观察表达绿色荧光 (图3A，3B)。免疫荧光检测GLSC-V细胞P63、Integrinβ1的表达情况。结果显示，该细胞中 P63、Integrinβ1都呈阳性表达，其中P63主要在核内表达 (图3C)，Integrin β1在胞质内表达 (图3D)。Hoechst 33342 染色细胞核呈蓝色荧光 (图3E，3F)。

图2 转染venus角膜缘干细胞荧光观察Fig. 2 GLSC-V showed green fluorescence. (A) Light microscope image of GLSC-V (200×). (B) Fluorescent microscope image of GLSC-V (200×).

图3 GLSC-V免疫荧光检测Fig. 3 Immunofluorescent staining of GLSC-V. (A, B) GLSC-V showed green fluorescence (200×); (C) GLSC-V were identified by immunofluorescence using a cy3-conjugated antibody against P63 protein (Red); (D) GLSC-V were identified by immunofluorescence using a cy3-conjugated antibody against Integrinβ1 protein (Red); (E, F) GLSC-V were mounted with Hoechst 33342 to mark the nuclei of all cells (Blue).

3.3.2 相关基因半定量RT-PCR检测

对第 6代 GLSC-V与 GLSCs进行半定量RT-PCR检测。从电泳结果看 (图4)，两种细胞的内参β-actin表达量一致。GLSC-V中p63及pcna表达较GLSCs略有上调，两种细胞的k3、k12均未见表达，GLSC-V中的venus荧光基因表达，GLSCs细

胞无venus表达。

3.3.3 生长曲线绘制及群体倍增时间

观察第4代GLSC-V与GLSCs生长曲线 (图5)，前 3天，两种细胞的细胞增殖差异不明显；在第 5天时两种细胞进入对数增长期，第 6天细胞增殖走势缓慢；第 7天细胞开始衰退。GLSC-V群体倍增时间为 (18±0.5) h，GLSCs为 (19±0.5) h。

图4 GLSC-V与GLSCs基因的半定量RT-PCR分析Fig. 4 Semiquantitative RT-PCR analysis of GLSC-V and GLSCs. Representative semiquantitative RT-PCR profles showing mRNA expression of p63 (440 bp), pcna (154 bp), k3 (145 bp), k12 (150 bp), venus (495 bp), β-actin (157 bp) by GLSCs and GLSC-V.

图5 GLSC-V与GLSCs细胞生长曲线Fig. 5 Growth curves of GLSC-V and GLSCs.

3.4 荧光角膜上皮植片的检测

3.4.1 生物学特征观察

GLSC-V细胞接种20 min后就几乎贴附于去上皮羊膜，细胞多呈圆柱样，少有不规则多角形。4~5 d后细胞已汇合呈单层，荧光倒置显微镜下，几乎所有细胞表达绿色荧光 (图 6A，6B)，降低培养液平面后细胞逐渐分层。通过光镜观察最上层细胞体积变大，呈扁平状。

图6 GLSC-V在羊膜上汇合成片Fig. 6 The GLSC-V were confluent on denued AM. (A) Light microscope image of GLSC-V on denude AM (50×). (B) Fluorescent microscope image of GLSC-V on denude AM (50×).

3.4.2 组织结构观察

常规组织切片 HE染色显示荧光角膜上皮复合组织共 5~6层细胞连续贴附于羊膜基底膜上 (图7A)，正常角膜上皮细胞有5~10层左右 (图7B)；两种上皮组织的上表2~3层细胞体积较大且呈扁平状(图7黑色箭头所指部分)；基底部细胞较为密集，而且有一小部分体积小且立方状的细胞 (图 7红色箭头所指部分)。

图7 荧光角膜及正常角膜上皮组织观察Fig. 7 Histological observation of artificial and normal corneal epithelium using HE staining. (A) Artificial fluorescent corneal epithelium (200×). (B) Normal corneal epithelium (200×). Note a few smaller and cuber shape of cells (red arrow) compared to other epithelial cells, the superficial epithelial cells (black arrow) were flattened and larger size shown in (A, B).

3.4.3 免疫化学检测

将人工角膜在荧光倒置显微镜下观察，可见绿色荧光标记的细胞层 (图8A)。P63免疫荧光检测显示角膜上皮植片中仅基底部最下一层致密细胞表达P63，其余细胞都不表达P63，这符合角膜缘干细胞位于角膜缘基底层的结构特点 (图 8B)。通过Hoechst 33342标记角膜上皮细胞核显示人工角膜上皮共有5~6层构成 (图8C)。

4 讨论

图8 荧光常角膜上皮免疫荧光检测Fig. 8 Immunofluorescent staining of fluorescent corneal epithelium. (A) The artificial corneal epithelium showed green fluorescence. (B) The lowest basal cells of fluorescent corneal epithelium expressed P63 (Red). (C) The fluorescent corneal epithelium with pVenus were mounted with Hoechst 33342 to mark the nuclei of all cells (Blue).

随着角膜缘干细胞研究报道日渐增多，LSC的定位、分离、培养问题已基本得到解决。目前，关于眼表疾病的基础研究主要致力于LSC微环境调控其增殖、分化的机制及LSC移植受损机体后的细胞移行、黏附、增殖和分化能力的变化[8]。并且 LSC作为组织工程角膜上皮的种子细胞，为临床眼科疾病用药物筛选提供细胞模型为眼表面重建及各种眼表疾病的治疗开辟广阔的前景。

许多研究者通过使用釉基质基因探针技术、特异性 DNA 探针技术、荧光原位杂交技术、限制性片段长度多态性分析和X、Y 染色体等方法追踪供体细胞长期存活情况[21]。Henderson等用 DNA 指纹技术检测 5位病人在进行异体角膜缘干细胞移植3~5年后供体来源干细胞的存活情况，结果发现在病人眼表检测不到供体来源干细胞[22]。尽管使用分子手段检测供体细胞具有简便灵敏度高等优点，但并不能实现供体角膜细胞的实时观察及检测。故本研究选用黄色荧光蛋白 Venus标记角膜缘干细胞，长期追踪供体细胞存在情况。相比 GFP、Venus产生的荧光更强，灵敏度更高，并且 Venus对 pH和Cl−有较强的耐受性，对细胞毒害作用小，在细胞中表达稳定，其独特的优势已成为细胞生物学示踪剂研究中的重要工具[23]。

目前还没有公认的标准来确定某种蛋白或某些蛋白可以作为LSCs的标志物。根据对比未分化细胞表达的标志性因子研究看，认为可作为角膜缘干细胞的阳性标记物有：ABCG2、K19、Integrin-α9、Integrin-β1、P63、Vimentin等；角膜缘干细胞阴性标记物有：K3、K12、Cx43、Involucrin、P-cadherin等[24]。经免疫化学检测，Venus荧光标记的角膜缘干细胞P63、Integrin β1呈阳性表达，说明转染细胞具有低分化能力。p63是抑癌基因家族成员之一，其对于表皮发育的再生性增殖起关键作用，是公认的角膜缘干细胞的核转录因子[25-26]。pcna是评价细胞增殖状态的指标之一。GLSC-V与GLSCs半定量RT-PCR结果发现，GLSC-V中p63表达量是GLSCs的1.5倍，GLSC-V中pcna表达量是GLSCs的1.2倍。两种细胞中 p63、pcna表达差异，可能是由于挑取选择得到的绿色荧光阳性克隆来源于原始干细胞，故 GLSC-V的阳性标记物表达量较 GLSCs更高。GLSC-V与GLSCs中k3及k12均无表达，说明GLSC-V并未分化，仍然维持干细胞活性。从第4代GLSC-V与GLSCs生长曲线趋势图来看 (图5)，第4代GLSC-V前5天活力较GLSCs差，可能是由于脂质体转染细胞后，脂质体对细胞有一定的毒害作用，而且每次传代后G418的筛选作用，也可能会影响细胞活力，随着转染细胞逐渐适应，细胞活力趋于稳定；并且GLSC-V与GLSCs的群体倍增时间无差异，说明转染后细胞经培养筛选稳定后，增殖能力并未下降。

目前角膜缘干细胞移植的手术方式主要包括：自体角膜缘干细胞移植；异体角膜缘干细胞移植；体外培养自体角膜缘干细胞或异体角膜缘干细胞移植。角膜缘干细胞体外培养移植所需的角膜缘组织少，避免对健眼的伤害，并且经体外培养角膜组织相容性抗原-DR (HLA-DR) 阳性朗格罕氏细胞减少，降低了同种异体角膜缘干细胞移植的免疫排斥[27]。体外培养和移植角膜缘上皮细胞首选载体就是人羊膜，羊膜具有低抗原性、促进上皮化、抑制炎症和新生血管的形成、抑制成纤维化、减少瘢痕形成等优点[28-29]，许多研究者通过使用羊膜治疗眼表疾病。

本研究先将 Venus标记角膜缘干细胞接种在去上皮羊膜上培养形成细胞单层，再进行气液界面培养。角膜上皮细胞同皮肤表皮细胞相似，生理环境下暴露于空气中，使用气液界面对于上皮细胞的生长、分化起了极为重要的作用。角膜上皮细胞层由5~10层细胞构成，位于无血管的透明结缔组织表面。上皮细胞层自前向后可分为表层、中层、深层和基底膜，表层为多边形鳞状上皮细胞；中层为翼状细胞层；深层即基底细胞层为单层的柱状上皮细胞，角膜缘干细胞就位于上皮细胞基底层底部。对正常和荧光角膜上皮组织进行 HE病理染色发现，两种上皮组织的上表2~3层细胞体积较大且呈扁平状，是典型的分化角膜上皮细胞，随着细胞层数增多，细胞数目增多，而且在基底部一小部分区域还可以观察到体积小、立方状的细胞，这种细胞形态与角膜缘干细胞形态一致。此外，经免疫荧光检测 P63结果发现，荧光人工角膜上皮组织中仅基底部最下一层致密细胞表达 P63，这是符合角膜缘干细胞分布在上皮基底部最基层的特点。

综上所述，本研究建立的山羊角膜缘干细胞荧光蛋白 (Venus) 细胞株仍具备正常角膜缘干细胞的生理特性，可作为组织工程化种子细胞；并且体外构建的荧光角膜上皮具有与正常角膜上皮相似结构特征，可用于角膜上皮移植实验，为今后研究角膜缘干细胞移植修复机理提供重要的实验材料。

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