外源性热休克蛋白70基因对心肌细胞损伤的保护作用

刘季春 万 力 何 明

(1.南昌大学第一附属医院心脏外科,江西南昌 330006;2.南昌大学医学院药学系,江西南昌 330006)

热休克蛋白(heat shock protein,HSPs)对心肌细胞损伤的保护作用引起国内外心血管界的极大兴趣与高度关注[1]。动物经热处理后其离体、在体心脏或经热处理后的心肌细胞均可诱导HSP70的生成,并可明显改善缺血/再灌注损伤后左室收缩功能与心肌酶谱、缩小梗死面积、减轻心肌细胞超微结构损伤。进一步研究提示:上述保护作用与 HSP70 mRNA和蛋白质的表达量成正比[2],HSP70作为一种内源性心肌保护物质,在心肌缺血预适应的延迟保护作用中发挥重要作用[3]。本研究以脂质体为基因转导载体,将高表达的pCDNA HSP70质粒导入大鼠心肌细胞,比较所表达的HSP70对心肌细胞急性实验性缺氧/复氧(A/R)损伤的保护作用及其与热休克心肌细胞保护模型之间作用的异同,并对其机制进行探讨。

1 资料与方法

1.1 实验动物 SD新生大鼠(1～3 d),雌雄不拘,由江西医学院医学实验动物科学部提供。

1.2 大鼠心肌细胞的原代培养 参照Spector等[4]方法略加改进,下列操作均在超净工作台内进行。取30只出生1～3 d内SD大鼠,消毒后开胸取出心脏,立即放入预冷的D-Hank液中,剪开心脏冲洗3次,取心室肌并剪成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块,加入无钙、镁 0.1%胰蛋白酶溶液 10 mL,36℃磁力搅拌8 min,吸取上层混悬液丢弃;再加入无钙、镁0.1%胰蛋白酶溶液10 mL于组织中消化8 min,再次移弃上清液;向组织中续加10 mL胰蛋白酶液消化,吸取消化后的上清液,加含15%FBS的MEM培养基10 mL,在温度10℃环境中离心6 min,转速1 000 r◦min-1,再向组织加入0.1%胰蛋白酶溶液10 mL消化,反复多次,直到组织碎块消化,细胞分离完毕。所收集的细胞用含15%胎牛血清的MEM培养基混悬后,置CO2培养箱(5%CO2、95%空气,37℃)培养 2 h,用差速贴壁法去除成纤维细胞,将悬浮的心肌细胞过200目不锈钢网,计算细胞悬液中台盼蓝复染的活细胞数达90%以上。用培养液调整细胞浓度为5×105个◦mL-1,之后分别按5×105个/孔和105个/孔接种于24孔培养板或96孔培养板内,于37℃,5%CO2、95%空气条件下培养,隔天换培养液,开始3 d加入0.1 mM Brd U抑制纤维细胞生长。培养第3天进行随机分组实验。

1.3 大鼠心肌细胞A/R损伤模型与HS保护模型的制作

1.3.1 心肌细胞A/R液制备 参照Koyama等[4]和Xu等[5]方法,取培养相应时间的心肌细胞,对培养的心肌细胞以缺氧、缺糖模拟缺血,以恢复氧和糖的供应作为再灌注。模拟缺血溶液(NaH2PO4 0.9 mM,NaHCO3 6.0 mmol◦L-1,CaCl2 1.8 mmol◦ L-1,MgSO41.2 mmol◦ L-1,HEPES 20 mmol◦ L-1,NaCl 98.5 mmol◦L-1,KCl 10.0 mmol◦L-1,p H 6.8,37℃)预先用95%N2、5%CO2混和气体饱和1 h;模拟再灌注溶液(NaCl 129.5 mmol◦L-1,KCl 5.0 mmol◦ L-1,NaH2PO40.9 mmol◦ L-1,NaHCO3 20 mmol◦L-1,CaCl2 1.8 mmol◦L-1,MgSO4 1.2 mmol◦L-1,葡萄糖 55 mmol◦L-1,HEPES 20 mmol◦ L-1,p H 7.4,37℃)预先用95%O2、5%CO2混和气体饱和1 h。用模拟缺血溶液置换正常培养溶液即缺血,用模拟再灌注溶液置换缺血溶液即为再灌注。

1.3.2 心肌细胞A/R损伤模型 实验时,弃培养液,换模拟缺氧液,将培养板置于持续95%N2、5%CO2平衡的缺氧密闭容器中(37℃)3 h,再换上模拟再灌注液,以95%O2、5%CO2进行复氧孵育2 h(37℃)。

1.3.3 心肌细胞HS保护模型 实验分组后,即刻将HS组心肌细胞置入42℃中培养1 h;转入正常心肌细胞培养48 h,再进行A/R损伤实验。

1.4 p CDNA HSP70质粒-脂质体复合物和转导人p CDNA HSP70质粒由美国芝加哥大学王山鸣教授惠赠,经扩增和纯化,与脂质体在室温下混合10 min。按照操作说明书将该复合物与心肌细胞混合,完成心肌细胞转导。

1.5 实验分组 随机分为4组,对照组、缺氧/复氧(A/R)组、热休克处理后缺氧/复氧(A/R+HS)组和p CDNA HSP70质粒转导后缺氧/复氧(A/R+pCDNA HSP70)组。每次实验复孔,重复4次。处理时间按图1进行。

1.6 细胞存活率 采用MTT比色法[6]检测。心肌细胞培养于96孔培养板,接种密度为105个/孔,每孔液体200μL。去培养液,复氧2 h后各组每孔加入MTT溶液(5 mg◦mL-1)20μL,孵育4 h,每孔加入150μL DMSO,振荡10 min,选择490 nm 波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。设不加细胞只加孵育液的空白对照,记录结果。细胞存活率=(实验组光吸收值/对照组光吸收值)×100%。

1.7 生化检测 实验结束后各组分别取孵育液200μL,用美国 Beckman生化自动分析仪测定LDH活性。

1.8 透射电镜观察 实验结束后,先用细胞刮刮下细胞,用4℃预冷的 PBS清洗,2.5%戊二醛、1%锇酸常规固定、脱水、包埋、超薄切片、醋酸铀-枸橼酸铅双染色。用日本H-600型透射电镜观察、摄片。

1.9 大鼠心肌细胞HSP70 mRNA检测(RT-PCR)

提取大鼠心肌细胞总RNA,经总RNA质量、浓度检测与标化,建立逆转录反应体系。引物设计参照文献[7];β-actin作为对照。HSP70引物:sense(5-AAC-GTG-CTG-CGG-ATC-ATC-AA-3);antisense(5-CTG-GAT-GGA-CGT-GTA-GAA-GT-3);产物长度为 347 bp。β-actin引物:sense(5-TCA-TCA-CCA-TTG-GCA-ATC-AG-3);antisense(5-GTC-TTG-GCG-TAC-AGG-3);产物长度为154 bp。PCR反应条件如下:热启动:94℃2 min;变性:94℃45 min;退火:55℃45 min;延伸:72℃1 min;经30个循环后,72℃3 min结束。取扩增产物15μL上样,1.5%琼脂糖凝胶电泳。定量计算方法为:所得HSP70产物带与β-actin产物带的综合密度之比,再除以对照组相对应样本的此两条带综合密度之比。

1.10 大鼠心肌细胞 HSP70蛋白检测(Western blot) 用预冷PBS洗心肌细胞3遍。加预冷溶解缓冲液,6孔板:200μL/孔;60 mm培养皿:500 μL/板。4℃孵育60 min。用细胞刮棒把细胞碎片连同细胞裂解液集中于一侧,并转移至预冷的Eppendorff管中。离心(12 000 g,4℃)10 min。取上清液,行心肌细胞总蛋白浓度的测定(Folin酚法)与标化。取含同等蛋白量的样本稀释至等体积,和5×蛋白上样缓冲液按4∶1体积混匀,100℃水浴5 min,趁热加样,每孔道10μL,加样后凝胶放置于装有电泳缓冲液的电泳槽进行电泳。随后于转移液中平衡10 min,120 mA×60 min转膜。转膜后,将NC膜置TTBS漂洗液中,进行考马斯亮蓝法胶染。依次结合一抗和羊抗大鼠IgG-HRP二抗,显影,曝光。将胶片扫描后,在医学图形分析系统上进行分析。计算方法为所得HSP70蛋白带的综合密度除以Control组相对应样本的综合密度。

1.11 心肌细胞内Ca2+的检测[8]实验结束后,弃去相应的处理液,加入负载指示剂(Fluo-3的终浓度为2μM)避光37℃孵育30 min后用分离缓冲液(detach buffer)冲洗,并在分离缓冲液中孵育10 min。低速离心(1 000 g)收集洗脱的细胞,弃去上清液,并用测定缓冲液(assy buffer)重新悬浮细胞,于流式细胞仪上检测,激发波长为488 nm,随机测定单个心肌细胞的荧光强度值,取10万个心肌细胞的荧光强度值的平均值为每份标本的测定值。

1.12 数据处理 定量资料以均数土标准差(¯x±s)表示,采用统计软件SPSS11.5进行方差齐性检验、单因素方差分析,组间比较用LSD法;定性资料用卡方检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞存活率 对照组大鼠心肌细胞存活率分别为86.2±10.9;HS+A/R组与pCDNA HSP70+A/R组存活率分别为 73.1±12.2、77.6±12.5,较A/R组显著增加(33.8±7.3,P＜0.01),表明热休克和pCDNA HSP70质粒转导可对抗A/R损伤所致细胞存活率的下降。

2.2 各组心肌细胞培养液中 LDH活性 对照组大鼠心肌细胞培养液中LDH活性为2.3±0.4,HS+A/R组与pCDNA HSP70+A/R组培养液中LDH 活性分别为 12.1±2.7、10.9±2.3,较 A/R组(20.6±3.4)明显降低(P＜0.01),表明热休克和pCDNA HSP70质粒转导可对抗A/R损伤所致细胞培养液中LDH活性升高。

2.3 各组心肌细胞超微结构改变 电镜下,A/R组心肌细胞肌原纤维排列尚整齐,肌浆网明显扩张呈空泡状,线粒体肿胀、结构破坏,嵴紊乱、稀疏;HS+A/R组、pCDNA HSP70+A/R组心肌细胞肌原纤维排列整齐、横纹清晰,线粒体结构基本正常,表明热休克与pCDNA HSP70质粒转导均可有效地对抗大鼠心肌细胞A/R所致的细胞超微结构的改变。

2.4 各组心肌细胞HSP70mRNA表达 在对照组心肌细胞未见有HSP70 mRNA的表达。A/R组心肌细胞可见有少量的HSP70mRNA表达,而HS+A/R组、pCDNA HSP70+A/R组心肌细胞表达显著增加,分别是A/R组的1.82±0.26倍和2.05±0.33倍(P＜0.01),两者间也有显著差异(P＜0.01),表明心肌细胞的热休克保护模型及pCDNA HSP70质粒转导均已成功,且后者增加HSP70 mRNA作用更强。

2.5 各组心肌细胞HSP70蛋白表达 对照组心肌细胞未见有HSP70蛋白表达。A/R组心肌细胞可见有少量 HSP70蛋白表达,而 HS+A/R组、pCDNA HSP70+A/R组心肌细胞表达显著增加,分别是A/R组的2.33±0.31倍和3.26±0.42倍(P＜0.01),两者间也有显著差异(P＜0.01),表明心肌细胞热休克保护模型及pCDNA HSP70质粒转导均已成功,且后者增加HSP70的表达作用更强。

2.6 各组心肌细胞内Ca2+的改变 扣除背景的荧光量后,对照组心肌细胞内Ca2+为11.84±1.37,A/R组为 23.21±2.81,明显高于对照组(P＜0.01);而 HS 组、pCDNA HSP70组分别为 15.56±1.62、14.24±1.65,明显低于 A/R 组(P＜0.01),表明热休克和pCDNA HSP70质粒转导可对抗大鼠心肌细胞A/R损伤所致的细胞内Ca2+升高。

3 讨 论

研究表明,许多应激原(包括热休克、缺血、压力和容量负荷、药物)都能诱导心肌表达HSP70。更有实际意义的是通过热处理增加细胞热耐受力的同时,也增加了对其他应激原的耐受,反之亦然,即交叉保护现象[9]。因此如何迅速诱导HSP70高水平表达具有临床意义。目前,提高心肌细胞HSP70含量的方法有两类:诱导内源性HSP70表达和导入外源性HSP70基因。热休克预处理与缺血预处理是诱导内源性HSP70表达的经典方法。但这两种方式因其固有的创伤性及保护作用的时间局限性,且无法预测心血管疾病的发生和预处理的难控制性,不能作为一种临床疗法进行治疗。

用某些药物进行干预、诱导,即药理性缺血预适应保护,确实可有效诱导HSP70蛋白在心肌细胞中表达,产生心肌保护作用。实验证明,中药有效成分阿魏酸钠[10],可诱导HSP70蛋白表达,对大鼠急性心肌细胞损伤产生药理性缺血预适应保护。

近年研究提示,利用分子生物学技术,将外源性HSP70基因导入心肌细胞中以提高HSP70基因的表达水平,也可保护心肌免遭急性损伤。基因疗法是随着分子生物学进展而出现的一种全新治疗方法。任何基因疗法需采用安全、方便、无毒的措施将目的基因传递至靶细胞或靶器官。向细胞内转移目的基因的方法可分为两大类:病毒载体途径和非病毒载体途径。但以病毒为载体的转基因技术不但安全性问题尚未完全解决,而且无法估计插入宿主细胞内基因长期稳定表达所引起的远期生物效应之利弊[11],使其临床应用受到极大的限制。

在本研究中,我们将pCDNA HSP70转导入大鼠乳鼠原代培养的心肌细胞内,经48 h孵育,成功诱导出HSP70mRNA及其蛋白的高表达,其与同步进行的热处理诱导出的HSP70蛋白一样,表现出强大的抗急性A/R损伤作用。使在遭受急性A/R损伤后,心肌细胞存活率大幅度提高,细胞培养液中LDH、CPK等心肌损伤标记物活性明显降低,细胞超微结构基本接近正常;利用pCDNA HSP70质粒转染获得的心肌保护效果与热休克预处理无明显差异,表明外源HSP70基因表达可起到保护作用,反之也证明HSP70是热休克预处理中起主要作用的因子。

心肌缺血再灌注损伤的主要病理生理学改变之一是心肌细胞内的游离钙含量急剧增加,出现钙超载。本研究证实:急性 A/R处理使心肌细胞内Ca2+含量明显增加;热休克处理可抑制这种增加;pCDNA HSP70质粒转导所引起HSP70蛋白高表达,在使心肌细胞急性A/R损伤明显减轻的同时,也可对抗这种增加;提示HSP70蛋白对抗急性心肌细胞损伤的作用至少部分与对抗细胞内Ca2+含量的增加、防止心肌细胞内钙超载有关。

综上所述,HSP70蛋白作为生物体内广泛存在的一种应激蛋白,可快速、短暂调整应激过程中细胞的存活机能,保护细胞免遭损伤,并有助于细胞恢复正常的结构和机能。在急性心肌损伤过程中不论用何种方法诱导出的HSP70蛋白,均可有效地对抗大鼠急性心肌损伤。其抗损伤机制与对抗细胞内Ca2+含量的增加、防止心肌细胞内钙超载有关。

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