曲古抑菌素A抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和诱导其凋亡的作用

朴松山 金铁峰 金虎日

(1.延边大学附属医院普通外科,吉林延吉 133000;2.延边大学医学部病理教研室,吉林延吉 133000;3.延边大学附属医院胸外科,吉林延吉 133000)

在我国,乳腺癌占全身各种恶性肿瘤的7%～10%;在女性其发病率仅次于子宫颈癌,并呈不断增高的趋势。曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)是链霉菌属Hygropicus的产物,为有效的氧肟酸类组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylases,HDACs)抑制剂,广谱地抑制HDAC1,HDAC2,HDAC5和HDAC6的基因及蛋白表达。曲古抑菌素能使肿瘤与正常组织中的组蛋白乙酰化,诱导转化细胞分化或凋亡,还可以诱导转化细胞中p21wafl的表达上升[1]。本文通过研究曲古抑菌素A对体外培养的人乳腺癌细胞系生长的抑制作用和诱导凋亡作用,探讨其抗肿瘤的作用机制,为临床治疗乳腺癌提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 主要试剂 曲古抑菌素A购自美国Sigma公司,乳腺癌MCF-7细胞株来源于美国ATCC(A-merica type culture collection)组织库,p21鼠抗人单克隆抗体购自武汉博士德公司;ABC免疫组织细胞化学检测试剂盒为福州迈新生物技术开发有限公司产品。小牛血清(fetal bovine serum,FBS)、1640培养基、噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)等化学试剂购自北京华美公司。

1.2 细胞培养 将RPMI-1640培养基粉末10.4 g溶于 1 000 mL双蒸水中,加入2 g NaHCO3,磁力搅拌至完全溶解,调整pH值至7.2。加入青霉素和链霉素使最终浓度各达到100 U。然后在每900 mL培养基中加入已灭活胎牛血清100 mL,经过滤器过滤除菌,分装后-20℃保存备用。另取少量培养液至培养皿中,置37℃培养箱中24～48 h,确定无污染后使用。复苏MCF-7细胞株,稳定传代。

1.3 细胞增殖抑制实验 用二甲氧唑黄比以法(XTT)(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)检测细胞生存率。取状态良好的处于对数生长期的MCF-7细胞培养24～48 h,用0.25%胰蛋白酶液消化、制成单细胞悬液并在显微镜下进行细胞计数,最终细胞悬液的浓度为 1×105◦mL-1。取100μL细胞悬液加入96孔板的每1个孔,使每孔最终细胞数为1 000个,置于37℃培养箱中培养过夜。第2天,应用TSA工作稀释液使终浓度分别达到 100、200、300、400 nmol◦L-1。然后各取100μL的TSA稀释液加入96孔板,每个浓度重复3次,每组设 RPMI-1640空白对照组。置于37℃培养箱中加药处理48 h后,取出培养板,在每孔加入新鲜配制的XTT液100μL,置于37℃培养箱中孵育4 h后上机检测,用酶标仪在492 nm波长测定吸光值,并按公式计算细胞生存率:细胞生存率(%)=实验组吸光值/对照组吸光值 ×100%。实验重复3次,取平均值进行统计学分析。

1.4 免疫细胞化学染色方法 将1×105◦mL-1MCF-7细胞接种于装有盖玻片的 6孔板上,在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h,使细胞贴壁生长。实验组用200 nmol◦L-1丁酸钠处理,对照组只加培养液,分别培养24 h、48 h和72 h后,弃去培养液,用PBS冲洗,用95%乙醇固定15 min,收集标本。免疫细胞化学染色方法根据ABC试剂盒说明书步骤进行。p21wafl鼠抗人单克隆抗体的稀释比例均为1:50。具体步骤如下:(1)PBS冲洗5 min×3次;(2)分别加入100μL单抗工作液,4℃下过夜;(3)PBS冲洗 5 min×3次;(4)加入二抗(抗鼠IgG),室温下孵育30 min;(5)PBS冲洗5 min×3次;(6)加显色剂DAB工作液,显微镜下观察至阳性显色明显时用自来水冲洗,终止显色;(7)苏木素复染1 min,自来水冲洗 10 min;(8)逐级脱水、透明,中性树胶封片。

1.5 免疫细胞化学染色结果判定 p21wafl以细胞核呈棕黄色颗粒为阳性。采用双评分半定量法进行蛋白表达评分:(1)靶细胞的阳性率＜25%为0分,25%～50%为1分,51%～75%为2分,＞75%为 3分;(2)染色反应的深度记分为0～3分,根据染色深度以多数细胞的呈色反应为准,不着色为0分,浅棕黄色为1分,棕黄色为2分,深棕黄色为3分。根据上述两项的记分之和分为4级,即:阴性(-)为0分,弱阳性(+)为l～2分,阳性(++)为3～4分,强阳性(+++)为5～6分。每张涂片在高倍镜下观察10个视野,每个视野下分别计数阳性细胞数和总细胞数并计算阳性表达率。阳性表达率(%)=阳性细胞总数/总细胞数×100%。

1.6 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件行统计学分析。数据以均数±标准差表示,XTT数据处理采用方差分析,免疫细胞化学阳性表达率的行χ2检验。

2 结 果

2.1 不同浓度TSA对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用 当 TSA 浓度为 100、200、300、400 nmol◦L-1时,对MCF-7细胞体外生长均有抑制作用,并呈明显的剂量依赖关系。不同浓度与时间组之间比较有显著性差异(P＜0.05),见表1。

2.2 MCF-7细胞的形态学改变 在倒置显微镜下观察,TSA处理前的细胞(图1A)呈三角形或多边形,状态良好;TSA处理12 h后的细胞(图1B)明显肿胀,拉长呈椭圆形。

2.3 TSA对MCF-7细胞p21wafl蛋白表达的影响

对照组(未经TSA处理的)MCF-7细胞p21wafl蛋白的表达在24 h、48 h和72 h时均呈弱阳性(+),实验组(经TSA处理的)MCF-7细胞p21wafl蛋白的表达在24 h、48 h和72 h时呈强阳性(3+)。实验组p21wafl蛋白的阳性表达率与对照组相比有显著性差异(P＜0.01),见表2和图2。表明,TSA可上调p21wafL蛋白在乳腺癌癌细胞中的表达。

表1 不同浓度TSA(nmol◦L-1)作用不同时间对 MCF-7细胞增殖生存率的影响(¯x±s)

表 2 TSA对MCF-7细胞p21wafl蛋白表达的影响(¯x±s)

3 讨 论

恶性肿瘤的靶向治疗近年来有了突破性进展[2],新的靶向治疗药物也不断涌现。曲古抑菌素A(TSA)是一种氧肟酸类HDAC抑制剂,为一种抗真菌类药物,能抑制组蛋白去乙酰化酶的活性,这类HDAC抑制剂被证明在小剂量、低浓度情况下可导致肿瘤分化,并选择性地抑制肿瘤生长而对正常细胞无毒副作用[3]。有研究[5]报道TSA对乳腺癌细胞MDA-MB-231的主要的杀伤作用是通过上调ERα和下调MMP-9来完成的。

本研究显示在TSA的干预下,MCF-7细胞的生长受到了抑制。这种抑制呈时间和剂量依赖形式,即随TSA作用时间的延长和药物剂量的增大,细胞生长抑制程度逐渐增加。在本实验中,将100 nmol◦L-1的TSA作用于MCF-7细胞24h,就可以抑制癌细胞生长,提示TSA对人乳腺癌细胞系MCF-7的增殖具有很好的负调控作用,这为其在乳腺癌临床化疗中的应用提供了实验依据。

p21wafl基因是1993年底由 Harper等[4]发现的一种新的抑癌基因,它为单拷贝基因,定位于人染色体6p21.2上。p21wafl作为野生型p53基因的下游靶基因的转录产物,是细胞周期蛋白(cyclin)与细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependentkinase,CDK)的广泛抑制剂,可与多种cyclins/CDK复合物结合抑制底物磷酸化,导致G1期细胞生长阻滞,通过这一作用抑制细胞的无限增殖[5]。本实验结果显示p21wafl蛋白表达在对照组呈弱阳性,在实验组呈强阳性。表明TSA可明显上调p21wafl蛋白的表达,从而抑制乳腺癌细胞的增殖。

1 Boyault C,Sadoul K,Pabion M,et al.HDAC6,at the crossroads between cy toskeleton and cell signaling by acetylation and ubiquitination[J].Oncogene,2007,26(37):5468-5476.

2 Han ES,Lin P,Wakabayashi M.Current status on biologic therapies in the treatment of epithelial ovarian cancer[J].Cur r Treat Options Oncol,2009,Epub ahead of print.

3 Huang H,Zhang zX Xu YJ.et al.exp ression of p53,p21 in human lung adenoeareinoma A549 Cel Strains under Hypoxia conditions and the effect of TSA on their expression[J].Journal of Huazhong university of Science and Technology,2003,23(4):359-361.

4 Harper JW,Adami G R,Wei N,et al.The p21 Cdkinteracting protein Cipl is a potent inhibition of G1 cyclindependent kinases[J].Cell,1993,75:805-816.

5 Shapiro G I.Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment[J].Clin Oncol,2006,24:1770-1783.