胃萎宁胶囊对萎缩性胃炎伴肠上皮化生抑癌基因蛋白表达的影响

陆 敏 王德明 王 焱 田耀洲 夏军权 朱方石 王春如 滑永志(江苏省中西医结合医院消化科,江苏南京 210028)

胃黏膜肠上皮化生作为癌前病变,与胃癌发生有密切联系,目前尚无疗效满意的治疗药物。本研究采用复方植物药制剂——胃萎宁胶囊治疗慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生患者40例,探讨其对患者抑癌基因蛋白PTEN和p16表达的影响。

1 资料与方法

1.1 研究设备 Olympus H260型前视式高清晰电子胃镜,CV-260型全数字电子内镜影像处理机,德国Zeiss公司Microm-340E型石蜡切片机,英国Shandon公司 Hypercenter-XP组织脱水机,英国Shandon公司 Histocentre-2型组织包埋机,HPLAS-1000高清晰彩色病理图文报告管理系统。

1.2 研究试剂 均为丹麦Dako公司产品。PTEN试剂:Mouse-Anti-Human,Clone:28H6,Code NO:GT201002。p16试剂:Mouse-Anti-Human,Clone:6H12,Code NO:GT201310。

1.3 研究药物 胃萎宁胶囊,每粒0.4 g,由江苏省现代中药制剂工程技术研究中心提供,批号:苏药制字Z04000321。

1.4 研究对象 萎缩性胃炎伴肠上皮化生患者共40例,其中男性28例,女性12例,年龄平均59.4±11.6岁。诊断标准按2006年中华医学会消化病学分会制定的《中国慢性胃炎共识意见》。本研究获得医院伦理委员会批准,所有研究对象知情同意。

1.5 研究方法

1.5.1 治疗方法 萎缩性胃炎伴肠上皮化生患者均口服胃萎宁胶囊,4粒,每日 3次(餐后),疗程60 d。治疗前后均行电子胃镜及病理检查。

1.5.2 肠上皮化生HE染色 胃黏膜活检标本均常规用10%中性甲醛固定,石蜡包埋,HE染色并切片,依据固有腺体萎缩程度、黏膜肌层增厚、肠上皮化生、固有膜炎症、淋巴滤泡形成来检测。

1.5.3 免疫组化检测 胃黏膜标本共80个(40对)。石蜡切片常规脱蜡、水化,PBS漂洗,浸泡于3%H 2 O2(20 min)阻断内源性过氧化物酶,PBS(0.05 mmol◦L-1,pH 7.4)洗 3次 ,每次5 min。组织切片置于10 mmol◦L-1枸橼酸钠(pH 6.0)溶液,微波炉中沸腾 10 min,冷却到室温,用 PBS(0.05 mmol◦L-1,p H 7.4)洗 3次,每次 5 min。滴加正常山羊血清封闭液,室温 20 min。加入试剂,阴性对照用0.05 mmol◦L-1PBS代替一抗。4℃过夜。用 PBS(0.05 mmol◦L-1,p H 7.4)洗 3次,每次5 min。滴加生物素化二抗,20～37℃20 min,用 PBS(0.05 mmol◦L-1,p H 7.4)洗3次 ,每次5 min。滴加试剂SABC,20～37 ℃20 min,用PBS(0.05 mmol◦L-1,pH 7.4)洗 3次,每次5 min。8DAB显色,蒸馏水洗终止反应。

1.5.4 结果判断 细胞浆内见棕褐色颗粒染色为阳性。每个切片选5个高倍视野,按阳性细胞数占同类细胞总数的百分比来计算。≤5%为阴性(-),6%～25%为表达阳性(+),26%～50%为表达显著阳性(++),＞50%为表达强阳性(+++)。并以各细胞表达强度积分:(-)为0分、(+)为1分,(++)为2分,(+++)为3分。观察染色情况,并进行各组染色强度积分统计。

1.5.5 统计学处理 用SAS 6.12软件进行统计学分析。采用优效性分析,治疗前后疗效等级比较采用Wilcoxon秩和检验。所有假设检验采用双侧检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

萎缩性胃炎伴肠上皮化生患者,口服胃萎宁胶囊治疗后胃黏膜抑癌基因蛋白第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白的同源物基因(PTEN)的表达上调(P＜0.01);抑癌基因蛋白p16表达也上调,但差异无统计学意义(P=0.564)(表1,图1和图2)。

表1 抑癌基因蛋白表达结果(n=40)

3 讨 论

慢性萎缩性胃炎与胃癌发病关系密切,目前公认的模式为:慢性萎缩性胃炎→胃黏膜肠上皮化生→胃黏膜不典型增生(上皮内瘤变)→胃癌。其过程与多基因改变有关,包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活、原癌基因的扩增及癌基因产物的过度表达。

胃萎宁胶囊为国家名老中医王德明所创,以益气健脾、行瘀化痰为治则,在临床已应用12年余,颇有良效,具有较完整的制作工艺和药理学、毒理学质控标准[1]。本研究采用胃萎宁胶囊治疗慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生,并探讨了其对抑癌基因蛋白PTEN与p16的作用。结果显示治疗前后患者胃黏膜抑癌基因蛋白PTEN的表达差异有统计学意义,而抑癌基因蛋白p16的表达差异无统计学意义。表明胃萎宁胶囊作为植物药复方制剂,其多途径、多靶点效应的本质,可能与其上调抑癌基因蛋白PTEN的表达相关。

PTEN基因是第1个被发现的具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因,已经证实PTEN基因的表达水平与多数消化系统肿瘤的发生、发展及预后有关[2]。大量研究证据表明PTEN是一个强有力的抑癌基因,其突变频率可以与p53相匹敌,这些特点使其成为p53之后最引人注目的一种抑癌基因。

PTEN基因的生物学功能主要包括以下两个方面:(1)在信号转导和凋亡中的作用;(2)与细胞粘附、铺展和迁移行为有关。细胞黏附力下降为肿瘤转移前提之一,黏着斑(focaladhesion kinase,FAK)为整合蛋白信号分布于黏着斑复合物,FAK表达的增加和活化在细胞迁移中具有重要作用,而重组PTEN可使FAK体外脱磷酸化。Kang等[3]采用具甲基化特异性PCR检验了PTEN的甲基化状况,在310例胃癌标本中,62例(20%)免疫组化示PTEN表达缺失,这种改变与肿瘤的浸润深度、大小、淋巴浸润、进展期及患者的生存率有很大的关联。

PTEN基因被称为后p53时代突变最多的抑癌基因[4]。PTEN基因表达缺失可促进胃癌血管生成,并在胃癌的进展和转移中起关键作用,其表达在胃癌的发生、进展、生长、分化和血管生成中起重要作用。胃萎宁胶囊上调了抑癌基因蛋白PTEN的表达,促使肠上皮化生逆转,达到抑制胃癌发生的目的。

肠上皮化生的发病机制尚处于探索阶段,幽门螺旋杆菌毒力因子、肠道特异性转录因子、微卫星不稳定性等均参与其发病环节,单独根除幽门螺旋杆菌似乎不足以逆转肠上皮化生,联合应用其他化学阻断剂以及中医药,可能是一条新的治疗途径。而且肠上皮化生和萎缩常呈灶状分布,有限的几点活检标本的代表性以及多次活检的部位差异性等都可能对最后结果产生影响,幽门螺旋杆菌定标活检技术(marking targeting biopsy,MTB)的应用可增加诊断及治疗效果评价的准确性[5]。

总之,胃萎宁胶囊治疗萎缩性胃炎伴肠上皮化生有临床疗效,其机制可能与其调控抑癌基因蛋白PTEN的表达相关。但其有效成分复杂,对原癌基因的扩增及抑癌基因的作用还需进一步深入探讨。

1 陆 敏,王德明,王春如,等.胃萎宁胶囊治疗萎缩性胃炎伴肠上皮化生的临床研究[J].中医药导报,2008,14(9):21-23.

2 常晓华,姜爱民,张 超,等.大肠癌中Survivin、PTEN、p16的表达及其临床意义[J].中国临床医学,2007,14(1):31-32.

3 Kang YH,Lee HS,Kim WH,et al.Promoter methy lation and silencing of PTEN in gastric carcinoma[J].Lab Invest,2002,82(3):285-291.

4 Park GS Jo YE,Kim HS,et al.Expression of PTEN and its correlation with angiogenesis in gastric carcinoma[J].Korean JGastroenterol,2005,46(3):196.

5 Si JM,Sun LM,Fang YJ,et al.Trial of a novel end oscopic tattooing biopsy forceps on animai model[J].World J Gastroenterol,2005,11(12):1859-1861.