缺血预处理对无心跳供体大鼠移植肺缺血再灌注损伤的保护作用

徐松涛 郭卫刚 谭黎杰 丁建勇 王 群

(复旦大学附属中山医院胸外科,复旦大学呼吸病研究所,上海 200032)

供体严重短缺是开展肺移植最主要的制约因素[1]。肺是唯一不依赖灌注进行细胞呼吸的器官,肺实质在循环停止以后仍可能存活一段时间[2],这是无心跳供体(non-heart-beating-donor,NHBD)肺移植的理论基础。缺血预处理(ischemia preconditioning,IP)是指通过短暂的缺血-再灌注刺激启动内源性保护机制,从而增强对接下来更严重的缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)的抵抗,这涉及改变细胞内的能量代谢、离子通道和细胞骨架的介质等[3-4]。迄今对肺IP的研究报道仍然较少[3],未见有关IP在NHBD肺移植领域的体内研究报道。

我们已经成功建立了可以耐受1 h热缺血时间的NHBD大鼠同种异体左肺原位移植模型[5]。本实验拟研究IP对热缺血1 h的NHBD大鼠移植肺的IRI是否有影响及其作用机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,体质量220～260 g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司(SINO-BRITISH SIPPR/BK LAB ANIMAL Ltd.)提供。

1.2 主要试剂和器材 5-羟基癸酸盐(5-hydroxydecanoate sodium salt,5-HD)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)(美国SIGMA公司);丙二醛(malondialdehyde,MDA)、总抗氧化能力(total antioxidative capacity,T-AOC)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);大鼠白介素6(IL-6)、大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫诊断试剂盒(美国Adlitteram Diagnostic Laboratories);低钾右旋糖苷(low patassium dextran,LPD)液[Perfadex(r),Vitrolife AB,瑞典Goteborg公司];动物呼吸机(美国 Harvard volume ventilators,Inspira ASV)。1.3 动物分组 将32只SD大鼠按供受体随机配对成16对,分成4组施行NHBD同种异体左肺原位移植。分别为 NHBD热缺血1 h组(对照组,NHBD 1 h)、IP 组(实验组,IP)、IP+5-HD(实验组,IP+5-HD)和 IP+DMSO(溶剂对照组,IP+DMSO),每组4对。NHBD 1 h组供受体鼠均无预处理措施;IP组供体鼠放血前先给予IP;IP+5-HD组供体鼠给予IP,受体鼠移植术前30 min给予5-HD 5 mg◦kg-1腹腔注射;IP+DMSO组供体鼠给予IP,受体鼠移植术前给予同等剂量溶剂DMSO腹腔注射。5-HD必须溶于DMSO,设立溶剂对照组的目的是为了观察DMSO是否影响实验结果。

1.4 动物手术和标本采集 各组热缺血时间均为1 h。IP方案为开胸后夹闭大鼠左侧肺门5 min,开放10 min,然后放血处死大鼠。热缺血1 h后,摘取供肺置于4℃LPD液中4 h,然后采用“袖套”法行同种异体左肺原位移植。

再灌注 10 min、1 h、2 h,分别抽取 0.15 mL 颈动脉血测血气。再灌注10 min、1 h、2 h,记录呼吸机上显示的气道压力(Paw),根据公式CL(L/cmH2 O)=肺容积变化(Vt)/跨肺压的变化(ΔP),得出相应的双肺顺应性数值。再灌注2 h后从原切口进胸,抽取0.2 mL左肺静脉血测血气;随后从颈动脉抽血处死动物,采血约2 mL置入离心管,以3 000 r◦min-1离心 20 min,取上清液100μL置于冻存管,-80℃冰箱保存待测。自左侧肺门离断移植肺,切取上1/3肺组织测定肺湿/干质量比值(W/D);切取下1/3制作病理切片和电镜标本;余肺切成100 mg左右小块放入冻存管,-80℃冰箱保存待测。病理切片由富有经验的病理科医师双盲读片。光镜下病理评分基于以下变量:肺泡和间质水肿,中性粒细胞浸润,出血,坏死。严重程度评分如下:无损伤=1(无该项病理改变);损伤25%=2(病理变化轻且很局限);损伤50%=3(病理变化中等且局限),损伤75%=4(病变中等但广泛或局部很显著);弥漫性的损伤=5(非常显著的广泛性病理改变)。每个样本有3个切片,被随机分析,平均值作为样本的评分。透射电镜观察细胞超微结构变化。

1.5 实验方法 测定移植肺组织总蛋白含量(考马斯亮蓝染色法)、移植肺组织和血清 MDA含量(TBA法)、移植肺组织和血清 T-AOC、肺组织MPO活性、移植肺组织和血清TNF-α和IL-6含量(双抗体夹心ABC-ELISA法)、细胞凋亡(TUNEL法)(按试剂盒说明书操作)。

1.6 统计学方法 所有数据均用SPSS 13.0软件进行统计分析,计量资料采用均数±标准差描述,各组之间比较采用单因素方差分析,如参数间的差异有统计学意义,则进一步采用Student-Newman-Keuls进行各组间参数的两两比较。P＜0.05表示参数间的差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血气分析 将再灌注后右颈动脉血PaO2数值减去自身未移植前PaO2的数值,可以大致反映移植肺的氧合情况(表1),结果显示再灌注10 min、1 h和2 h时,IP组术后氧合优于NHBD 1 h和IP+5-HD组(P＜0.05)。再灌注2 h后,比较各组左肺静脉血PaO2数值可以更准确地反映移植肺的氧合(表2),IP组优于NHBD 1 h组以及IP+5-HD组(P＜0.05)。

2.2 双肺顺应性 表3显示再灌注1 h和2 h,IP组双肺顺应性优于NHBD 1 h以及IP+5-HD组(P＜0.05)。

2.3 再灌注2 h移植肺W/D数值、组织形态学改变和凋亡 表4显示移植肺再灌注2 h,IP和IP+DMSO组W/D数值较低,肺水肿程度较轻(P＜0.05)。光镜下观察各组均可见肺泡壁塌陷,间质血管扩张充血,实质及间质内白细胞浸润,肺泡腔内有红细胞及渗出液。NHBD 1 h组和IP+5-HD组肺损伤程度相对较重;IP组以及IP+DMSO组肺泡结构损害、肺间质水肿、间质血管充血程度减轻,肺泡腔内有散在红细胞漏出,可见少量渗出。但各组移植肺损伤程度评分的差异无统计学意义。IP组以及IP+DMSO组的凋亡指数显著高于NHBD 1 h组和IP+5-HD组(P＜0.05);IP+5-HD组与NHBD 1 h组的差异无统计学意义(图1)。

表1 4组再灌注后右颈动脉血PaO2与自身术前值差的比较(¯x±s)

表2 4组再灌注2 h右颈动脉和左肺静脉血PaO2数值比较(¯x±s)

表 3 4组再灌注后肺顺应性数值比较(¯x±s)

表4 4组再灌注 2 h移植肺W/D、光镜下肺损伤程度评分和凋亡指数比较(¯x±s)

图1 4组细胞凋亡比较(TUNEL×250)A:NHBD 1 h;B:IP;C:IP+5-HD;D:IP+DMSO

电镜下观察NHBD 1 h和IP+5-HD组可见内皮细胞水肿、空泡化、线粒体肿胀、部分可见嵴断裂,细胞间隙增大。Ⅰ型细胞扁平,胞浆空泡化明显,部分线粒体膜破坏。Ⅱ型细胞线粒体肿胀明显,线粒体嵴减少,细胞质空泡化明显,肺泡隔明显肿胀。IP组和IP+DMSO组各型细胞结构较完整,轻度肿胀,线粒体嵴部分模糊,空泡增多,损伤较NHBD 1 h组和IP+5-HD组轻。

2.4 再灌注2 h的过氧化指标和细胞因子 比较移植肺再灌注2 h时各组血清和肺组织MDA、血清和肺组织T-AOC含量、肺组织MPO含量以及肺组织TNF-α和 IL-6蛋白定量,结果示IP组和IP+DMSO组与NHBD 1 h组的差异均有统计学意义(P＜0.05);IP+5-HD组与NHBD 1 h组的差异均无统计学意义;各组血清TNF-α和IL-6浓度之间的差异无统计学意义(表5)。

表5 4组再灌注2 h的过氧化指标和细胞因子比较(¯x±s)

3 讨 论

1986年,Murry等[6]在研究犬心肌梗死模型时提出了IP的概念。相对其他器官而言,对肺的IP研究报道较少[3-4],至今未见有关IP在肺移植领域的临床应用,也未见有关IP在NHBD肺移植领域的体内研究报道。本实验结果显示,IP能够减轻NHBD移植肺再灌注早期各时间点右颈动脉血PaO2降低的程度,再灌注2 h的左肺静脉血PaO2水平显著高于未预处理组,提示IP能够改善NHBD移植肺的氧合功能。此外,IP还能改善再灌注2 h移植肺的顺应性,减轻肺水肿程度,减少细胞凋亡,改善肺组织形态学变化。因此,IP对NHBD移植肺的IRI有较强的早期保护效应。

早先在心肌IP的研究中,多采用短暂“缺血-再灌注”4至6个循环,以诱导IP的保护作用。一般认为应该在最终引起损伤的“缺血-再灌注”前即刻进行预处理。至于预处理究竟应该持续多久,预处理几次,各类研究方法和对象不同,所得出的结论也有差异。近几年来,研究者们普遍采用单次“缺血-再灌注”方案,在肝、肾等的IP研究中,单次方案对IRI的保护效果与以往多次循环方案类似[7]。本实验采用单次5 min缺血+10 min再灌注的IP方案,结果显示对热缺血1 h的NHBD供肺同样能够产生保护作用。

IP可能的最终效应包括改变细胞内ATP、糖类和蛋白质代谢,离子通道和细胞骨架的介质。IP可以减少IRI过程中的能量需求,减缓代谢产物的堆积,减少糖酵解。IP对组织产生延迟保护作用的介质包括了NO合成酶、COX-2、醛糖还原酶、Mn-SOD、热休克蛋白和ATP敏感的钾通道(ATP-sensitive potassium channels,K-ATP)等[3-4,8]。本实验结果显示移植肺再灌注2 h时,IP组的血清MDA和肺组织MDA含量较对照组显著降低,血清和肺组织 T-AOC显著增高,肺组织 MPO含量以及TNF-α和IL-6含量显著降低,提示IP可以提升移植肺和机体的总抗氧化能力,减轻脂质过氧化水平,减少再灌注早期肺组织中性粒细胞的聚集和细胞因子的释放,抑制移植肺的炎性反应,减轻IRI程度,从而对热缺血1 h的NHBD供肺产生保护作用。而这种保护作用可以被线粒体K-ATP阻断剂5-HD消除,说明线粒体K-ATP开放在IP对IRI的早期保护机制中起到了重要作用。另外,5-HD的溶剂DMSO对本次实验结果无明显影响。

本实验结果显示,移植肺再灌注2 h时,肺组织中TNF-α和IL-6含量在IP组显著低于对照组,而血清中两者的浓度在各组间均无显著差异,说明再灌注早期,IP的效应主要还是作用在靶器官,对机体的全身炎性反应影响不大。

1 Bar r ML,Bourge RC,Orens JB,et al.Thoracic organ transplantation in the United States,1994-2003[J].Am J Transplant,2005,5(4 Pt 2):934-949.

2 Date H,Matsumura A,Manchester JK,et al.Evaluation of lung metabolism during successful twenty-four-hour canine lung reservation[J].J Thorac Cardiovasc Surg,1993,105:480-491.

3 Luh SP,Yang PC.Organ p reconditioning:the past,current status,and related lung studies[J].J Zhejiang Univ Sci B,2006,7:331-341.

4 朱 颖,刘 蓉,刘文新,等.兔局灶性脑缺血预处理诱导缺血耐受的实验研究[J].中国临床医学,2008,15(5):602-604.

5 徐松涛,郭卫刚,谭黎杰,等.无心跳供体大鼠同种异体左肺原位移植模型的热缺血时限[J].复旦学报(医学版),2008,35:720-725.

6 Murry CE,Jennings RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986,74:1124-1136.

7 Torras J,Herrero-Fresneda I,Lloberas N,et al.Promising effects of ischemic preconditioning in renal transp lantation[J].Kidney Int,2002,61:2218-2227.

8 Hausenloy DJ,Yellon DM.Survival kinases in ischemic preconditioning and postconditioning[J].Cardiovasc Res,2006,70:240-253.