基质金属蛋白酶在冠状动脉内膜增厚中的作用研究

李 化 王春生 陈志强 丁文军 赵 东 洪 涛 陈 昊

(复旦大学附属中山医院心外科,上海市心血管病研究所,上海 200032)

基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组拥有超过20种降解细胞外基质成分的含2价锌离子的水解酶,各种MMPs之间有相互交叉的底物,但每种MMP至少能降解1种细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白。在血管壁中,MMPs由各种细胞合成并分泌或表达在细胞膜表面,有促ECM新陈代谢和血管壁重构的作用。MMPs的转录、合成和活性在冠脉粥样硬化斑块的纤维帽中明显上调,促进斑块破裂[1]。MMPs的表达异常能造成血管壁的结构改变[2-3]。

由于正常人冠状动脉存在的一定程度的内膜增厚[4]构成了各种病理性冠脉内膜增厚的基础,而冠状动脉内膜增厚所致管腔狭窄是许多心脏疾病的基础病理学改变。我们猜想MMPs降解ECM的作用异常可能会导致冠脉内膜的增厚。以往关于MMPs在冠脉中的作用研究多局限于动物实验[2,5-6]或人体颈动脉或冠状动脉内膜切除术中取出的部分内膜组织[1,3]。本研究利用扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)心脏移植术中获取的完整冠状动脉组织,用Western blot半定量法检测MMPs蛋白在冠脉壁中的表达,探讨MMPs与冠脉内膜增厚的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 在2004年10月—2007年5月行心脏移植术的患者中选择20例无心肌缺血的临床表现、病理检查显示冠脉无粥样硬化病变的DCM患者。提取术中取出的受体心脏的左前降支冠状动脉,取一小段用10%福尔马林固定,将余下冠脉的外膜仔细从中层分离,使所取的冠脉中层和内膜层组织量达到0.3 g。

1.2 MMPs的检测 用Western blot半定量法检测冠状动脉壁内MMPs的蛋白表达。将冠脉的中层和内膜组织作成匀浆,加RIPA裂解液,复合蛋白酶抑制剂(Roche公司),13 000 g离心30 min,取上清液。用Lowry法(Pierce Biotech公司)测蛋白浓度,还原型上样缓冲液,10%SDS胶,每孔上样量50 μg。硝酸纤维素膜转膜。第 1抗体:小鼠抗人MMP-1、2、3、9、13、14单克隆抗体(EMD Chemicals公司),4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶(H RP)标记羊抗小鼠IgG(KPL公司)作为第2抗体25℃孵育1 h。底物为ECL发光试剂(Pierce公司),用小鼠IgG(Abcam公司)代替一抗作为阴性对照。小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(Santa Cruz公司)作为内参。扫描显影后的条带,用软件ImageJ 1.37V计算每条条带的总象素值。以每个标本目标条带与相应的GAPDH条带的总象素值比值作为该蛋白的检测结果。

1.3 组织形态观察 将10%甲醛固定的冠状动脉用石蜡包埋,5μm间隔连续切片备用。行HE、弹性纤维 van Gieson染色(EVG)、Masson三色法(MT)染色,物镜(40×)下观察组织形态学变化,并拍照。应用软件ImageJ 1.37V计算中层和内膜层的面积,考虑到冠脉直径大小的取样误差,用内膜与中层面积比来定量内膜增厚的程度。

1.4 统计学分析 连续变量用平均数±标准差表示。Pearson直线相关分析2个变量的相关性,相关系数用r表示。P＜0.05认为差异有统计学意义。统计学分析用SPSS 11和Sigmaplot 8.0软件。

2 结 果

2.1 一般资料 20例DCM 患者年龄12～72岁,平均(42.9±16.6)岁;男性 14例,女性6例。3例(15%)患高血压,6例(30%)患糖尿病,4例(20%)患高脂血症。术前左心室射血分数10%～30%,平均(19.35±5.85)%。

2.2 组织形态学 结合HE、EVG、MT染色,发现20例DCM患者的冠状动脉均有不同程度同心圆形的内膜增厚(图1),内膜与中层面积比平均为0.83±0.33。内弹力纤维层较完整,偶有断裂;增厚的内膜为细胞纤维性,有时内膜内可见多层的节段状弹力纤维,少见纤维脂肪样细胞分布。

图1 DCM冠脉切片的HE和MT染色(×400)

2.3 MMPs表达与内膜增厚的相关性 Western blot半定量分析(图2)显示冠脉壁中的MMP-3蛋白(r=-0.62,P＜0.005)及 MMP-9蛋白(r=-0.47,P＜0.05)的表达和冠脉内膜与中层面积比呈负相关。冠脉内膜增厚的程度和MMP-1蛋白(r=0.207,P=0.387)、MMP-2蛋白(r=0.159,P=0.504)、MMP-13蛋白(r=-0.293,P=0.211)、MMP-14蛋白(r=-0.104,P=0.662)及年龄(r=0.281,P=0.23)无显著相关性。

图2 Western blot显示 MMP-1、2、3、9、13、14 蛋白条带

3 讨 论

鉴于心脏冠状动脉内膜增厚所致管腔狭窄是许多心脏疾病(如冠状动脉粥样硬化、冠脉成形术后再狭窄、移植心脏血管病变等)的基础病理学改变,所以研究冠脉内膜增厚的机制显得十分重要。以往研究[4]表明正常人存在一定程度的冠脉内膜增厚,这是各种病理性内膜增厚的基础。我们希望通过研究冠脉无粥样硬化病变的DCM患者的内膜增厚机制为冠脉疾病发生机制的研究提供一定理论基础。

ECM组成了细胞外复杂的支架系统,起着支撑细胞和组成细胞外微环境的作用,ECM合成的增加是冠脉壁增厚的重要机制之一。由于MMPs能降解组成ECM的各种蛋白成分,因此在各种冠脉疾病的发生机制中起着重要的作用。MMPs家族可分为 :(1)胶原酶 ,包括 MMP-1、8、13,裂解 I、II 和III型胶原的三倍体螺旋结构;(2)明胶酶,包括MMP-2、9,降解弹性蛋白和经胶原酶裂解后的胶原单体;(3)基质裂解素,包括MMP-3、10、11,降解蛋白聚糖、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白和胶原单体,其中MMP-3作用最强;(4)表达在细胞膜上的膜型MMPs,包括MT-MMP1(MMP-14)、2、3、4,降解明胶、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、波连蛋白和硫酸皮肤素蛋白多糖。另外还有基质溶解因子MMP-7、金属弹性蛋白酶MMP-12。本研究选择 MMP-1、2、3、9、13、14蛋白作为研究对象,分属于4种MMPs,基本上能涵盖MMPs在冠脉壁中的作用谱。

以往研究[2,6]表明消除MMPs基因的作用能促进病变动脉内膜的增厚。在敲除MMP-3基因的小鼠主动脉粥样斑块模型中,动脉粥样内膜增厚的程度以及动脉内膜内纤维化程度较未敲除基因的对照组明显增加[6]。同样的现象也出现在敲除MMP-3和MMP-9基因的小鼠头臂干动脉粥样斑块模型中[2]。在敲除组织MMPs抑制物-1(TIMP-1)基因后,MMPs的活性增强,可导致小鼠粥样斑块明显缩小并且出现动脉瘤样扩张[5]。通过对人体冠脉内膜切除术中取出的内膜组织的免疫组化染色,发现MMP-3高表达的冠脉的扩张程度较高,说明MMP-3通过降解冠脉壁的ECM造成冠脉直径的扩大[3]。以上报道均说明MMP-3和 MMP-9对ECM的降解在冠脉壁重构中的重要作用。

血管平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)在内膜层内的迁移、增生所引起冠脉内膜增厚已被公认为是诸多心血管疾病(如冠状动脉粥样硬化)的基本病理改变。我们通过免疫荧光染色也发现在DCM增厚的内膜层内存在SMC广泛增生(待发表中)。以往的研究发现,在通过基因转染组织MMP抑制物(TIMPs)的人大隐静脉中,MMPs作用受到抑制,而向内膜迁移的SMC明显减少并导致内膜增厚的程度减低[7];敲除 TIMP-1基因的小鼠MMP-2的活性增高,使损伤后的股动脉内膜的增厚程度和SMC的增生均高于对照组[8]。这种机制被认为是MMPs降解构成内膜基底膜的IV型胶原、层粘连蛋白和硫酸皮肤素蛋白多糖,从而促使SMC穿过基底膜由中层向内膜层迁移。本研究发现MMP-1、2、13、14的表达高低与内膜增厚无关联,可能是由于MMPs有促SMC迁移至内膜层使得内膜层增厚和降解内膜ECM两方面的作用,最终综合起来不会影响到冠脉内膜的增厚程度。

总之,本研究发现MMP-3和MMP-9的表达与冠脉内膜增厚程度呈负相关,说明在MMPs表达差异引起冠脉内膜增厚的机制中,MMP-3和MMP-9的下调起着重要的作用。

1 Jason LJ,Christopher LJ,Gianni DA,et al.Activation of matrix-degrading metalloproteinasesby mast cell proteases in atherosclerotic plaques[J].A rterioscler Thromb Vasc Biol,1998,18(11):1707-1715.

2 Jason LJ,Sarah JG,Andrew CN,et al.Divergent effects of matrix metalloproteinases 3,7,9,and 12 on atherosclerotic plaque stability in mouse brachiocephalic arteries[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:15575-15580.

3 Paul S,Geoffrey V,Khaled MZ,et al.Relation of matrix-metalloproteinase 3 found in coronary lesion samples retrieved by directional coronary atherectomy to intravascular ultrasound observations on coronary remodeling[J].Am J Cardiol,2002,89:1354-1359.

4 Stary HC.Macrophages,macrophage foam cells,and eccentric intimal thickening in the coronary arteries of young children[J].Atherosclerosis,1987,64:91-108.

5 Silence J,Collen D,Lijnen HR.Reduced atherosclerotic plaque but enhanced aneurysm formation in mice with inactivation of the tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1)gene[J].Circ Res,2002,90(8):897-903.

6 Silence J,Lupu F,Collen D,et al.Persistence of atherosclerotic plaque but reduced aneury sm formation in mice with stromelysin-1(M MP-3)gene inactivation[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2001,21:1440-1445.

7 Concepcion MA,Sarah JG,Jason LJ,et al.Relationship between type IV collagen degradation,metalloproteinase activity and smooth muscle cell migration and proliferation in cultured human saphenous vein[J].Cardiovasc Res,2003,58:679-688.

8 Lijnen HR,Soloway P,Collen D.Tissueinhibitor of matrix metalloproteinases-1impairs arterial neointima formation after vascular injury in mice[J].Circ Res,2002,91:1186-1191.