nNOS对小鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

2010-02-03 07:40卢晓梅于艳秋
中国医科大学学报 2010年11期
关键词:激酶磷酸化试剂盒

卢晓梅,于艳秋

(中国医科大学 基础医学院病理生理学教研室,沈阳 110001)

nNOS对小鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

卢晓梅,于艳秋

(中国医科大学 基础医学院病理生理学教研室,沈阳 110001)

目的 应用神经型一氧化氮合酶nNOS基因缺失小鼠,探讨nNOS对心肌缺血再灌注损伤的影响。方法 野生型C57小鼠和nNOS基因缺失小鼠分别经过冠状动脉左前降支缺血30min再灌注3h,观察TUNEL染色和caspase-8,-9,-3的活性变化,并用Western blot法观察磷酸化p38激酶和胞外信号调节激酶(ERK)的表达情况。结果 心肌缺血30min再灌注3h后,与假手术组相比,TUNEL阳性细胞数增加,caspase-8,-9,-3活性增强,差异有统计学意义(P<0.05)。野生组与基因缺失组相比,凋亡细胞数增多,caspase活性增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示野生型小鼠缺血再灌注损伤后磷酸化p38和ERK激酶活性增强,而基因缺失组p38激酶活性降低,ERK活性不受影响。结论 nNOS具有加重心肌缺血再灌注损伤的作用,其作用可能为p38介导。

缺血再灌注;神经型一氧化氮合酶;丝裂原激活的蛋白激酶

心肌梗死是常见的心血管事件,治疗时恢复血流却可能导致缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IR)[1]。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)通过催化产生NO在调节冠状动脉节律和心肌收缩性方面发挥重要的作用,然而其在缺血再灌注损伤中的作用却颇有争议。大部分数据显示诱导型 NOS(inducible nitric oxide synthase,iNOS)或者内皮型 NOS(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)在IR时起保护作用[2],另一些实验却发现iNOS或eNOS起损伤作用[3]。而神经型 NOS(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)虽然在心率、钙循环、钠转运和能量代谢中都发挥重要作用[4],但在心肌缺血再灌注损伤中的作用还不清楚。

应激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinases,SAPKs)包括胞外信号调节激酶(external-signal regulated kinase,ERK),Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase,JNK)和p38丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK),在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用。研究发现,缺血再灌注损伤导致的p38MAPK激活可以诱导细胞凋亡和组织损伤[5]。越来越多的研究证明NO参与SAPKs激活,但是nNOS在缺血再灌注损伤中对SAPKs的激活作用仍不清楚。

本研究应用nNOS基因敲除小鼠探讨了nNOS在心肌缺血再灌注损伤中的作用以及在此过程中SAPKs激活的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及分组:(1)基因缺失(KO)IR组(n=9):12周龄 nNOSKO鼠 (Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME,USA),雄性,体质量 25~30g;(2)野生型(WT)IR组(n=11):12周龄 C57BL/6小鼠(Clea,日本),雄性,体质量 25~30g;(3)WT假手术组(n=9);(4)KO假手术组(n=9)。均由日本香川大学医学部提供。

1.1.2 试剂:TUNEL试剂盒(Calbiochem,Darmstadt,Germany);caspase-3,-8,-9活性试剂盒(Chemicon International Inc.,USA);抗体(Cell Signaling Technology,USA);ECL发光系 统 (ECLkit,Amersham Pharmacia,GEHealthcare,UK);蛋白测定试剂盒(Bio-Rad,USA)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌缺血再灌注损伤模型制备:苯巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,人工呼吸机辅助呼吸。打开左前胸,暴露心脏。用7/0尼龙丝线在左心耳下方2mm结扎冠状动脉左前降支,显微镜下确认,结扎30min后松开恢复再灌注3h。假手术组打开胸腔暴露心脏,而不结扎动脉。灌注期结束取下心脏。

1.2.2 心肌细胞凋亡的测定:用TUNEL法测定。OCT包裹心脏组织制成4μm冰冻切片,染色。荧光显微镜观察荧光染色。每个标本取3张切片,每片测定10个区域,每个区域计算细胞核的数量以及TUNEL阳性细胞数量。caspase-3,-8,-9活性的检测根据试剂盒说明书进行。

1.2.3 Western blot测定MAPK蛋白表达:利用组织细胞裂解液抽提总蛋白,蛋白测定试剂盒测定组织蛋白含量。取等量的蛋白(50μg)进行SDS-PAGE电泳,转移到硝酸纤维素膜上,phospho-p38、phospho-ERK、总 p38、ERK、β-actin一抗孵育,4℃过夜。二抗孵育1h后,显色系统显色。Western blot条带用NIHImage software分析灰度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 死亡率

假手术组动物无死亡,WTIR组死亡率为27.3%,KOIR组死亡率为22.2%。

2.2 IR诱导的凋亡

TUNEL染色结果显示,WTIR组和假手术组凋亡细胞的阳性百分比为(14.58±0.28)%及(0.59±0.13)%;KOIR组和假手术组凋亡细胞的阳性百分比为(6.24±0.31)%及(0.58±0.15)%,与 WTIR组相比,KOIR组的TUNEL染色凋亡细胞的阳性百分比显著降低(P<0.05)。见图1,2。WT假手术组和KO假手术组caspase-3,-8和-9的活性没有明显差异,而在WTIR组它们的活性分别升至(1.68±0.12)倍、(2.23±0.11)倍和(1.48±0.09)倍,在 KOIR组它们的活性分别升至(1.32±0.06)倍、(1.61±0.09)倍和(1.25±0.08)倍,与WTIR组相比,KOIR组小鼠caspase活性明显降低(P<0.05)。见图3。

2.3 MAPK活性

为了研究nNOS和SAPKs激活在心肌IR中的作用,我们检测了磷酸化p38激酶和ERK,总p38激酶和ERK以及β-actin的表达情况。结果显示,与假手术组相比,WTIR组磷酸化的p38激酶和ERK的表达分别增加(2.00±0.23)倍和(1.50±0.20)倍。尽管与WT假手术组相比,KOIR组磷酸化的p38激酶的表达增加(1.24±0.09)倍,但是却显著低于WTIR组 (P<0.05)。KOIR组磷酸化的ERK也增加至(1.40±0.09)倍,但是与WTIR组相比无统计学意义。见图4,5。

3 讨论

越来越多的证据表明NOS在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用,尽管许多研究显示NOS在IR诱导的心肌损伤中起保护作用[6],然而,也有一些研究显示,心肌缺血再灌注损伤可诱导NO和超氧阴离子作用生成过氧亚硝酸盐,参与急性IR造成的损伤[7]。本研究发现,nNOS加重了小鼠心肌缺血再灌注损伤,可能与以下机制有关:(1)线粒体部位nNOS的激活可以导致一过性线粒体ATP抑制,从而抑制心肌收缩力;(2)心肌肌浆内nNOS激活,肌浆网局部释放NO,在心肌细胞钙离子调节及心肌收缩中发挥重要作用;(3)神经纤维内的nNOS激活降低了心率和氧耗。已有研究证明,nNOS基因缺失小鼠离体心脏梗死率降低,与本研究结果一致。尽管如此,nNOS在心肌缺血再灌注损伤中的确切作用仍然有待进一步研究。

哺乳动物细胞在心肌缺血后会激活一系列信号转导机制,导致心肌细胞不可逆的损伤。研究发现,缺血再灌注损伤可以激活ERK和p38。p38是争议最多的一条信号转导途径,多数研究证明,p38的激活或者发生在缺血时,或者在再灌注期延续时,抑制p38激活可延缓梗死的发展,增加细胞存活率,降低心肌细胞凋亡并增加缺血后心脏功能的恢复[8]。但也有研究发现,在缺血的致死期抑制p38MAPK不会影响IR诱导的损伤程度[9]。许多研究证明,NO参与SAPKs激活,eNOS抑制心肌缺血再灌注损伤时可见p38激酶的激活。本研究结果显示,p38激活在KOIR小鼠降低,说明p38参与了NOS介导的心肌IR损伤。

综上所述,本研究结果表明,在nNOSKO小鼠心肌损伤程度和p38磷酸化程度降低,说明nNOS具有加重心肌缺血再灌注损伤的作用,且该作用与激活p38有关。

[1]Ferdinandy P,Schulz R,Baxter GF.Interaction of cardiovascular risk factors with myocardial ischemia/reperfusion injury,preconditioning,and postconditioning[J].Pharmacol Rev,2007,59(4):418-458.

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(编辑 王又冬,英文编辑 陈 姜)

Effect of Neuronal Nitric Oxide Synthase on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Mice

LUXiao-mei,YUYan-qiu
(Department of Pathophysiology,College of Basic Medical Sciences,China Medical University,Shenyang 110001,China)

ObjectiveTo explore the effect of neuronal nitric oxide synthase (nNOS)on myocardial ischemia-reperfusion injury in mice.MethodsIn nNOS-/-(KO)mice and wild type C57(WT)mice,the left anterior descending coronary artery were ligated for 30minutes,followed by 3-hour reperfusion.The cardiac myocyte apoptosis was detected by TUNELstaining,and the activities of caspase-3,-8,and-9and the expressions of phospho-p38mitogen-activated protein kinase(MAPK)and extracellular signal-regulated kinase(ERK)were determined by Western blot.ResultsCompared with control group,the number of TUNELpositive cells and the activities of caspase-3,-8,and-9significantly increased after 30-minute ischemia followed by 3-hour reperfusion (P<0.05).The number of TUNELpositive cells and the activities of caspase-3,-8,and-9were significantly higher in WTmice than in KOmice (P<0.05).After ischemia-reperfusion injury,the activities of phospho-p38and ERKincreased in WTmice,but in KOmice,the activity of phospo-p38decreased and the activity of ERKwas unchanged.ConclusionnNOSmay exacerbate ischemia-reperfusion injury,in which p38MAPKmay be involved.

ischemia-reperfusion;neuronal nitric oxide synthase;mitogen-activated protein kinase

R363.2

A

0258-4646(2010)11-0919-03

辽宁省教育厅高校科研基金资助项目(20060946)

卢晓梅(1978-),女,讲师,硕士.

于艳秋,E-mail:yqyu@mail.cmu.edu.cn

2010-05-13

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