碱性成纤维细胞生长因子缓释膜延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究

田峰，田立杰，季相禄，赵巍

（中国医科大学 附属盛京医院手足外科，沈阳 110004）

碱性成纤维细胞生长因子缓释膜延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究

田峰，田立杰，季相禄，赵巍

（中国医科大学 附属盛京医院手足外科，沈阳 110004）

目的 探索应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）缓释膜是否能够延缓失神经骨骼肌萎缩的进程。方法 将28只大鼠左后肢制成失神经腓肠肌模型，随机分成2组，每组14只，A组腓肠肌内置入含有bFGF的缓释膜，B组腓肠肌内置入不含bFGF的缓释膜，术后30d取材，行腓肠肌组织学、肌湿重、肌动蛋白、肌纤维数量直径和纤颤电位波幅测定。结果 A组腓肠肌的肌纤维数量（15.8±3.4）条和直径（16.5750±3.8192）μm 均较 B组的（11.8±3.4）条和（10.6750±4.6760）μm 多和粗（P<0.05），A组肌肉的湿重（1.6907±0.4229）g，肌动蛋白含量（451.1241±47.1316）和纤颤电位波幅（0.1945±0.0420）μV均较 B组的（0.9320±0.0885）g，（378.2125±71.6568），（0.1552±0.0603）μV重、多和大（P<0.05）。结论 bFGF缓释膜可以延缓失神经肌萎缩的进程。

碱性成纤维细胞生长因子；失神经肌萎缩；大鼠

失神经骨骼肌萎缩影响肢体功能恢复一直是临床亟待解决的难题。虽然研究者对延缓失神经骨骼肌萎缩进行了许多探索［1］，但临床上尚无确定有效的方法。本文采用在大鼠失神经腓肠肌模型中置入含有碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）缓释膜的方法，探索应用bFGF缓释膜是否能够延缓失神经骨骼肌萎缩的进程。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康雄性，体质量250～350g的SD大鼠28只（购自中国医科大学实验动物中心）。大鼠随机分2组，每组14只，同体左后肢制成失神经支配腓肠肌模型，右后肢为正常。A组：左侧置入含有bFGF的缓释膜，B组：左侧置入不含有bFGF的缓释膜。

1.2 试剂

采用沈阳医学院研制的内含bFGF的生物降解膜（国家发明专利号200410021474.07），此膜在体内缓释降解，药物逐渐释放，维持局部一定的药物浓度（约 18ng/ml），缓释时间为 25～30d。

1.3 动物模型

暴露大鼠后肢坐骨神经并于中段切断，神经两断端分别反折固定于邻近组织，断端相距2cm；于实验侧腓肠肌中段肌膜下置入缓释膜，显微线缝合部分肌膜以固定。术后30d取材进行多种指标观察。

1.4 肌纤颤电位波幅测试

观察两组失神经腓肠肌纤颤电位波幅变化差异。

1.5 肌湿重测定

完整切下各组失神经腓肠肌，用电子秤测其质量。

1.6 组织学观察

将实验侧腓肠肌从肌腹中央横断取材，经10%中性缓冲甲醛液固定石蜡包埋，制成7μm厚的光镜切片。部分材料经HE染色及横纵断面连续切片，光镜下观察肌纤维结构萎缩的差异；部分材料按ABC法（卵自素、生物素和卵自素生物素复合物免疫酶法）常规制成肌动蛋白免疫组化染色标本（均设有阴性对照，试剂从Sigma公司购入），测量肌动蛋白染色后的灰度，邻近阴性部位的灰度作为背景灰度，两者的差值表示检测部位的实际灰度。

1.7 图像分析仪测定

两组腓肠肌横断面切片400倍光镜下测定同一单位面积内的如下内容：（1）肌纤维数量（条）；（2）肌纤维直径（μm）。

1.8 统计学方法

实验结果用SPSS11.0进行分析，两组间比较采用t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学观察结果

在纵横断面的HE染色切片上，两组实验侧腓肠肌均明显较其对照侧发生萎缩，肌纤维变细、变少，横纹不清，肌细胞核变多，肌间神经束均变成结缔组织索。实验侧腓肠肌A组较B组的肌纤维束完整，肌纤维排列紧密，肌纤维明显较B组的多而粗，横纹清楚的肌纤维和肌细胞核也较多（图1）。

2.2 腓肠肌湿重测定结果

实验侧腓肠肌平均湿重A组为（1.6907±0.4229）g，与 B组的（0.9320±0.0885）g比较，差异有统计学意义（P=0.0196）。

2.3 肌动蛋白灰度测定结果

实验侧腓肠肌肌动蛋白平均灰度A组为（451.1241±47.1316），与 B组的（378.2125±71.6568）比较，差异有统计学意义（P=0.0294），见图 2。

2.4 显微图像分析仪测定结果

实验侧腓肠肌纤维数量A组为（15.8±3.4）条，与B组的（11.8±3.4）条比较，差异有统计学意义（P=0.0122）。实验侧腓肠肌纤维直径A组为（16.5750±3.8192）μm，与 B组的（10.6750±4.6760）μm 比较，差异有统计学意义（P=0.0030）。

2.5 实验侧腓肠肌纤维纤颤电位波幅检测结果

实验侧腓肠肌纤维纤颤电位波幅A组为（0.1945±0.0420）μV，与 B组的（0.1552±0.0603）μV比较，差异有统计学意义（P=0.0238）。

3 讨论

周围神经损伤修复后，由于神经再生的速度极为缓慢，轴突需要相当长的时间才能达到周围靶器官，在靶器官重新获得神经支配之前肌肉就有可能发生不可逆转的萎缩。bFGF是含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽，对成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、肾上腺皮质和髓质细胞、神经元和神经胶质细胞等具有很强的促细胞分裂增殖活性［2］。

本研究结果表明应用bFGF缓释膜置入失神经腓肠肌中能够减轻肌纤维束萎缩进程，延缓肌间神经束纤维化的速度，减缓肌动蛋白、肌湿重及肌纤维颤电位的衰减速度。bFGF缓释膜能够保证药物浓度在局部组织维持，比单纯注射用药更有利于药效的发挥。

关于bFGF缓释膜能够延缓失神经肌萎缩的方法为首次提出，鲜见于其他公开文献中，本实验也是对其进行初步研究，其机制推测有以下几方面：

首先，Borisov等［3］研究表明长期失神经骨骼肌中肌卫星细胞数量的下降是造成神经修复疗效欠佳的重要原因。其他学者研究［4，6］表明bFGF在促进肌卫星细胞活性和成肌细胞的增殖分化方面具有显著效果。研究还表明缺血、缺氧、失神经支配等常导致骨骼肌内源性bFGF含量减少［7］。因此外源性bFGF能够激活肌卫星细胞向成肌细胞分化，并促使成肌细胞大量增殖分裂可能是其延缓失神经肌萎缩的机制之一。

其次，Rifin 等［8，9］研究表明 bFGF是体内发现的最为有效的血管形成因子之一，它对新生血管形成过程中多个环节如毛细血管基底膜降解，内皮细胞迁移增生，小血管腔形成等均有明显促进作用，因此bFGF也可以通过促进局部毛细血管增生，改善局部血供氧供起到延缓失神经肌萎缩的作用。

另外，bFGF还可以通过对аⅠ型前胶原基因表达的下行调节作用抑制胶原蛋白的合成，在促进正常胶原纤维形成的同时抑制其过度沉积［10］，避免了失神经骨骼肌间结缔组织过度增生对肌组织的缠绕挤压，这可能也是其延缓失神经肌萎缩的原因之一。

以上仅是bFGF延缓失神经肌萎缩的机制推测，bFGF缓释膜如何应用于临床及能否取得预期的疗效则需要进一步的实践来证明。

［1］李永平，梁炳生.失神经骨骼肌萎缩防治研究进展［J］.国际骨科杂志，2006：27（6）：341-343.

［2］陈惠，杨耀防.bFGF的生物作用分子机制研究进展［J］.九江医学，2009，24（1）：73-75.

［3］BorisovAB，DedkovEI，CarlsonBM.Differentiationof activated satellite cells in denervated muscle following single fusions in situ and in cell culture［J］.Histochem Cell Biol，2005，124（1）：13-23.

［4］Guthridge M，Wilson M，Cowling M，et al.The role of basic fibroblast muscle regeneration［J］.Growth Factors，1992，6（1）：53.

［5］Kujawa M，Baran W，Jankowska-Steifer E.Morphonmetric ultrastructural analysis of satellite cells in denervated rat soleus muscle［J］.Exp Mol Pathol，2004，76（2）：166-172.

［6］马焰，高伟，孙月芬，等.碱性成纤维细胞生长因子对培养的骨胳肌细胞生长作用的研究［J］.中国临床康复，2002，6（19）：2862-2863.

［7］Fu XB，Yang YH，Li XK，et al.Ischemia and reperfusion impair the gene expression of endogenous basic fibroblast growth factor（bFGF）in rat skeletal muscles［J］.JSurg Res，1998，80（1）：88-93.

［8］Rifin DB，Moscatelli D.Resent developments in the cell biology of basic fibroblast growth factor［J］.Cell Biol，1989，109（12）：1.

［9］俞桓锡，崔世军，藤旭，等.血管内皮生长因子-碱性成纤维细胞生长因子基因治疗家兔肢体缺血的研究［J］.中华实验外科杂志，2004，21（4）：406-407.

［10］Tan EM，Rouda S.Acidic and basic fibroblast growth factors downregulate collagen gene expression in keloid fibroblasts［J］.Am JPathol，1993，142（2）：463-470.

（编辑 武玉欣，英文编辑 陈 姜）

Delayed Effect of Basic Fibroblast Growth Factor on Denervated Skeletal Muscle Atrophy：An Experimental Study

TIANFeng，TIANLi-jie，JIXiang-lu，ZHAOWei
（Department of Hand Surgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo determine whether basic fibroblast growth factor （bFGF）could delay the process of denervated skeletal muscle atrophy.MethodsThe model of denervated skeletal muscle atrophy in rat left hindlimb was established.Atotal of 28rats were divided into 2groups （n=14each group）.Membrane containing bFGFand empty membrane were put into the denervated gastrocnemius in groups Aand B，respectively.Histological examination，measurement of the muscle weight，actin content，number and diameter of the muscle fiber，and electromyography were performed 30days after the operation.ResultsThere were significant differences in the number of muscle fiber，diamter of the muscle fiber，muscle weight，content of actin，and fibrillation potential amplitude between groups Aand B（number of the muslce fiber，15.8±3.4vs 11.8±3.4；diameter of the muscle fiber，16.5750±3.8192vs 10.6750±4.6760μm；msucle weight，1.6907±0.4229vs 0.9320±0.0885g；actin content，451.12411±47.1316vs 378.2125±71.6568；fibrillation potential amplitude，0.1945±0.0420vs 0.1552±0.0603μV；allP<0.05）.ConclusionbFGFcould delay the process of denervated skeletal muscle atrophy.

basic fibroblast growth factor；denervated skeletal muscle atrophy；rat

R651.3

A

0258-4646（2010）11-0925-02

田峰（1970-），男，副教授，硕士.E-mail：tianfeng2002@sina.com

2010-04-26