人端粒酶催化亚单位(hTERT)反义分子探针的制备与理化性质初步研究

王荣福，刘 萌，张春丽，闫 平

北京大学第一医院 核医学科，北京 100034

反义显像是将放射性核素标记的一段人工合成的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASON)引入体内后，根据“碱基互补配对原则”，追踪其与病变组织中过度表达的目标DNA或mRNA发生特异性结合的过程，从而达到在基因水平上早期、特异、定量诊断疾病的目的[1-2]。大量研究证实，人端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是迄今所知的人体肿瘤特异性最强的生物标志之一[3-4]，具有肿瘤特异诊断和治疗的潜在应用价值。基于以上认识，本研究提出以hTERT为生物靶点，制备一种新型的反义分子探针，并对其理化性质进行初步研究。

选择合适的放射性核素和适宜的标记方法是成功进行反义显像的关键问题。在所应用的临床显像药物中，放射性核素99Tcm及其标记的化合物约占总量的80%。99Tcm物理性能优良，为纯γ光子发射体；能量适宜，为140 keV；半衰期(T1/2)合适，为6.02 h；获取方便，可通过99Mo-99Tcm发生器产生；价格较为便宜；广泛应用于临床核医学多种脏器的显像诊断。因此，本研究拟选取放射性核素99Tcm标记针对hTERT mRNA的ASON，通过标记条件优化，制备反义分子探针。

1 实验部分

1.1 主要试剂、材料及仪器

根据ASON的设计原则以及文献报道[5]，针对hTERT mRNA的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASON)序列为5′-TAGAGACGTGGCTCTTGA-3′，正义寡核苷酸(sense oligonucleotide,SON)序列为5′-TCAAGAGCCACGTCTCTA-3′，每条链均为全硫代修饰，3′端连接一个伯氨结构，修饰结构式为5′-ASON-(CH2)6-NH2-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。双功能螯合剂S-Acetyl NHS-MAG3由美国Hnatowich D J博士赠送。SephadexG25(Fine)，瑞典Amersham公司。SnCl2·2H2O，美国Sigma公司。99Tcm洗脱液，中国原子能科学研究院同位素研究所。

SMA3000-UV-VIS型微量分光光度计，北京华大基因研究中心。真空离心干燥仪，美国LABCONCO公司。RM905型放射性活度仪，中国计量科学研究院。FT-163型放射免疫测量仪，国营二六一厂。AlphaImagerTM2200凝胶成像仪，美国Alpha Innotech公司。

1.2 ASON与NHS-MAG3的偶联反应

[6-7]报道，取5 OD ASON(OD即为吸光度值)，以HEPES缓冲液(0.1 mol/L，pH=8.0)溶解，质量浓度5 g/L。在振荡条件下，将新鲜配制的NHS-MAG3溶液加入ASON溶液中，使二者的最终摩尔比(MAG3/ASON)达到20∶1。室温下，静置反应60～120 min。反应产物通过Sephadex G25层析柱(0.7 cm×28 cm)纯化。洗脱液为PB缓冲液(50 mmol/L，pH=7.2)；洗脱产物按照每管0.4 mL收集。紫外分光光度计测定每管洗脱产物在260 nm处的波长吸收情况(OD260 nm)，计算产物含量(1 OD≈30 μg)。合并高峰管(OD260 nm值以及放射性活度值均最高的管)，以每管10 μg分装。真空离心干燥后，-20 ℃条件下保存、备用。质谱分析MAG3-ASON，由北京大学医学部医药卫生分析中心协助完成。

1.3 MAG3-ASON的放射性核素99Tcm标记

1.4 99Tcm-hTERT ASON的标记稳定性分析

取100 μL的99Tcm-hTERT ASON溶液，分别放置在以下条件：① 原液(室温)；② 加10倍体积的生理盐水(37 ℃)；③ 加10倍体积的人新鲜血清(37 ℃)，孵育不同时间(0、1、2、4、6、8、24 h)后，分别取样，纸层析法测定99Tcm-hTERT ASON的放射化学纯度。

1.5 99Tcm-hTERT ASON的序列稳定性分析

取1 μg的99Tcm-hTERT ASON，溶于正常人新鲜血清中；在37 ℃条件下孵育不同时间(1、2、4、6 h)后，分别采用酚/氯仿法[8]从人新鲜血清中提取99Tcm-hTERT ASON；取样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)检测。以未经血清37 ℃孵育的99Tcm-hTERT ASON作为对照组。

1.6 99Tcm-hTERT ASON的血清蛋白结合率

取100 μL的99Tcm-hTERT ASON，与人新鲜血清(100 μL)在37 ℃水育箱中孵育不同时间(1、3、6 h)。其后采用酚/氯仿法沉淀血清蛋白，即：加入酚/氯仿溶液(体积比为1∶1)，充分混匀5 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液；将沉淀物重复上述实验1遍；分别收集上清液和沉淀物，γ放射免疫计数器计数(C)。根据公式计算：血清蛋白结合率=100%C沉淀物/(C上清液+C沉淀物)。

1.7 统计学分析

2 结果和讨论

2.1 ASON与MAG3的偶联反应结果

图1 Sephadex G25凝胶层析结果Fig.1 Results of Sephadex G25 gel chromatographyA——MAG3-ASON， B——游离(Free)ASON

Sephadex G25凝胶层析可根据不同分子的分子量大小，有效分离偶联和未偶联的DNA以及未参与反应的双功能螯合剂。层析产物通过紫外分光光度计测定OD260 nm值，其中高峰管A为偶联产物(MAG3-ASON)，示于图1。偶联产物(MAG3-ASON)通过质谱分析，结果示于图2。图2(a)为ASON的质谱分析结果，显示其相对分子质量为5 448.5；图2(b)为MAG3-ASON的质谱分析结果，显示其相对分子质量为5 796.5，与计算值相近。

99Tcm为金属核素，其标记ASON最有效的方法就是在ASON末端加上一个合适的连接子，以使空间位阻最小化，然后通过连接子进行放射性核素标记。在ASON的3′端NH2与寡核苷酸骨架之间以己基(CH2)6作为连接子，有助于与螯合剂偶联。此外，应用双功能螯合剂还可避免由于放射性核素直接标记而导致的标记底物生物学活性的损伤[9]。S-Acetyl NHS-MAG3作为一种双功能螯合剂，常用于99Tcm标记[6]。在ASON的5′或3′末端连接一伯胺结构；ASON通过伯胺与NHS-MAG3发生化学反应，形成稳定的酰胺键；在室温和中性条件下，去除保护巯基的乙酰基基团；通过转螯合作用，NHS-MAG3就能与99Tcm螯合，从而形成稳定的放射性标记物，结构示于图3。

图2 质谱分析结果Fig.2 Molecular mass of probe measured by MOLDI-TOF analysis(a)——ASON，Mr=5 448.5；(b)——MAG3-ASON，Mr=5 796.5

2.2 MAG3-ASON的99Tcm标记结果

利用放射性核素99Tcm标记MAG3-ASON，不同标记条件下标记产物的标记率示于图4。

图3 99Tcm-NHS-MAG3-ASON结构示意图Fig.3 Structure of 99Tcm-NHS-MAG3-ASON

纸层析法测定标记产物的标记率与放射化学纯度。放射性核素99Tcm标记MAG3-ASON的反应产物有3种成分：① 游离锝；② 水解锝；③ 络合锝，即所需的标记产物99Tcm-hTERT ASON。前2种是放化杂质。3种99Tcm标记产物在展开体系中的比移值(Rf)列于表1。

图4 不同SnCl2用量液体积(b)和反应时间(c)下标记产物的标记率Fig.4 Labeling efficiency of the product in different conditions: the mass of SnCl2 (a), the volume of (b), reaction time(c)

表和99TcmO2的Rf值Table 1 Rf of 99Tcm-hTERT ASON, and 99TcmO2

按上述反应条件，室温下反应15～30 min后，99Tcm-hTERT ASON的标记率为76%±5%(n=5)；在相同条件下，无双功能螯合剂作用，ASON的标记率仅为5.0%±1.6%(n=5)；二者比较有显著差异(P<0.05)。99Tcm-hTERT ASON的放射化学纯度可达96%以上，比活度为1 850 GBq/g。

图5 Sephadex G25凝胶层析纯化Fig.5 Results of Sephadex G25 gel chromatography

2.3 99Tcm-hTERT ASON的标记稳定性分析结果

将99Tcm-hTERT ASON放置在不同条件下(室温、生理盐水室温孵育、正常人新鲜血清37 ℃孵育)，结果示于图6。图6结果表明，99Tcm-hTERT ASON在24 h内的放射性化学纯度均大于93%。

图6 不同条件下99Tcm-hTERT ASON在24 h内的放射化学纯度Fig.6 Radiochemical purity of 99Tcm-hTERT ASON at different conditions during 24 h ◆——室温(Room temperature)，●——生理盐水室温孵育(Incubation with normal saline at room temperature)，△——正常人新鲜血清37 ℃孵育(Incubation with fresh 37 ℃ human serum)

2.4 99Tcm-hTERT ASON的序列稳定性分析结果

体内应用时，不仅要保证99Tcm-hTERT ASON具有良好的放射稳定性，更要维持序列完整性，从而保证显像所必须的序列特异性。PAGE凝胶电泳主要用于检测小分子核酸的大小，或在同位素标记的情况下分析单链核酸，如分离寡核苷酸探针、S1核酸酶产物分析和DNA测序等。该方法适用于小分子DNA的分离(以5～500 bp最佳，其中bp表示碱基对)。对单链核酸来说，其分辨率可达1 bp。如果寡核苷酸发生降解，PAGE电泳结果上会出现异常条带。从本研究的PAGE电泳结果来看(图7)，仅在18 bp位置出现清晰的电泳条带。这说明99Tcm-hTERT ASON在人新鲜血清中未发生任何降解，序列稳定性良好。

图7 PAGE凝胶电泳分析Fig.7 PAGE Gel electrophoresisM——标准(Standard)DNA marker，1——对照组(未与血清孵育)(Control group without incubation)；与血清孵育组(Groups incubated with fresh 37 ℃ human serum )：2——1 h，3——2 h，4——4 h，5——6 h

2.5 99Tcm-hTERT ASON的血清蛋白结合率

将99Tcm-hTERT ASON放置在正常人新鲜血清(37 ℃)中孵育1、3、6 h后，其与血清蛋白的结合率分别为15.0%±1.6%、18.0%±1.9%、20.0%±2.4%。

在体内，一部分反义显像剂会与血清蛋白结合，这使其进入靶组织的量减少，而血液中放射性长期处于一较高水平，引起靶/非靶组织(T/NT)的放射性比值下降，从而影响显像质量。若反义显像剂与血清蛋白结合率过高，还会对机体造成额外伤害，更会对寡核苷酸的生物学特性造成严重影响。然而，反义显像剂与某些血清蛋白相互作用的消极意义从药物动力学角度来看却是有利的：其与血清蛋白的结合可使它的血清半衰期延长，且减慢肾脏排泄速度，有利于在肿瘤部位聚集。本研究结果显示，99Tcm-hTERT ASON与血清蛋白结合率在6 h内约为20%。99Tcm-hTERT ASON与血清蛋白发生结合，可能与硫代磷酸酯寡聚脱氧核糖核酸(phosphorothioate oligonucleotides,PS)的硫原子修饰结构有关。因为PS的主要缺点之一就是在体内会与一些蛋白结合，特别是那些能和带有多个负电荷分子相互作用的蛋白，这种非特异性结合的原因还不甚明了。

3 结 论

本课题选择hTERT为靶点，设计、修饰与其特异性结合的ASON序列，通过双功能螯合剂S-Acetyl NHS-MAG3进行放射性核素99Tcm标记。获得的标记产物99Tcm-hTERT ASON具有较高的标记率、放射化学纯度和比活度，且放射稳定性和序列稳定性良好，与血清蛋白具有一定的结合特性，适合作为反义显像剂用于进一步的显像研究[10-11]。

参考文献：

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